Isolasi Mikroba Lokal untuk PGPM dan Agen Pengendali Hayati APH

Panduan Praktis dari Pengambilan Sampel, Pemurnian Isolat, Uji Fungsi, hingga Pembuatan Media

Isolasi Mikroba Lokal untuk PGPM dan Agen Pengendali Hayati APH
BAB 1. PENGANTAR
BAB 2. PENDAHULUAN
Tahap 1: Pengambilan Sampel
Tahap 2: Pembuatan Suspensi Awal
Tahap 3: Pengenceran Bertingkat
Tahap 4: Penanaman pada Media
Tahap 5: Inkubasi dan Pertumbuhan Koloni
Tahap 6: Seleksi Koloni dan Pemurnian
Tahap 7: Uji Fungsi PGPM dan APH
Tahap 8: Kode Isolat, Penyimpanan, dan Uji Awal
Pembuatan Media
Lampiran. Grading Kemudahan Isolasi PGPM/APH dan Sumber Mikroba Lokal dari Alam
Lampiran 8. Ciri Morfologi Koloni Mikroba Target
Lampiran 9. Ciri Morfologi Berdasarkan Paket Pemula

BAB 1. PENGANTAR

Mikroba lokal merupakan salah satu sumber daya hayati penting dalam pertanian. Mikroba ini dapat ditemukan pada tanah rizosfer, akar tanaman sehat, kompos matang, serasah sehat, serta lingkungan pertanian yang produktif. Dari sumber-sumber tersebut, sebagian mikroba berpotensi dikembangkan sebagai PGPM dan APH.

PGPM adalah singkatan dari Plant Growth Promoting Microorganisms, yaitu mikroba pemacu pertumbuhan tanaman. Mikroba kelompok ini dapat membantu tanaman melalui berbagai mekanisme, seperti melarutkan unsur hara, menghasilkan senyawa pemacu pertumbuhan, mendukung perkembangan akar, atau meningkatkan vigor tanaman.

APH adalah singkatan dari Agen Pengendali Hayati, yaitu mikroba yang berpotensi membantu menekan patogen penyebab penyakit tanaman. Kelompok ini dapat bekerja melalui kompetisi ruang dan nutrisi, antibiosis, parasitisme terhadap patogen, atau membantu meningkatkan ketahanan tanaman.

Dalam praktik pertanian modern, penggunaan PGPM dan APH menjadi semakin penting karena keduanya dapat mendukung sistem budidaya yang lebih sehat, efisien, dan berkelanjutan. Namun, mikroba lokal tidak dapat langsung digunakan begitu saja. Sampel dari lapangan selalu mengandung campuran berbagai mikroba. Di dalamnya bisa terdapat mikroba bermanfaat, mikroba netral, mikroba pembusuk, bahkan mikroba yang tidak diinginkan.

Oleh karena itu, diperlukan prosedur isolasi yang sistematis agar mikroba yang diperoleh dapat dipisahkan, dimurnikan, diuji, disimpan, dan diseleksi dengan baik. Tulisan ini disusun sebagai panduan praktis untuk mengarahkan proses tersebut secara bertahap.

1.1 Tujuan Penulisan

Tulisan ini bertujuan memberikan panduan kerja yang runtut untuk:

Mengambil sampel mikroba lokal dari sumber yang aman.
Mengisolasi mikroba calon PGPM dan APH.
Memurnikan koloni mikroba menjadi isolat.
Menguji fungsi awal isolat sebagai pemacu pertumbuhan atau pengendali hayati.
Menyimpan isolat agar tetap tertata dan dapat digunakan untuk uji lanjutan.
Menyiapkan media yang diperlukan selama proses isolasi, pemurnian, uji fungsi, dan penyimpanan.

Dengan susunan ini, pembaca dapat memahami proses isolasi bukan sebagai satu langkah tunggal, tetapi sebagai rangkaian kerja yang saling terhubung.

1.2 Ruang Lingkup

Ruang lingkup tulisan ini meliputi dua bagian besar.

A. Prosedur Isolasi Mikroba

Bagian ini terdiri dari delapan tahap utama:

Pengambilan sampel.
Pembuatan suspensi awal.
Pengenceran bertingkat.
Penanaman pada media.
Inkubasi dan pertumbuhan koloni.
Seleksi koloni dan pemurnian.
Uji fungsi PGPM dan APH.
Kode isolat, penyimpanan, dan uji awal.

B. Prosedur Pembuatan Media

Bagian ini menjelaskan media yang digunakan selama proses isolasi dan uji fungsi, antara lain:

NaCl steril 0,85%.
NA atau Nutrient Agar.
TSA atau Tryptic Soy Agar.
PDA atau Potato Dextrose Agar.
Pikovskaya Agar.
NBRIP Agar.
Aleksandrov Agar.
King’s B Agar.
Starch Casein Agar.
YMEA.
Ashby Mannitol Agar.
N-free Malate.
CAS Agar.
Media agar miring atau slant.

1.3 Alur Besar Proses Isolasi

Secara umum, proses isolasi bergerak dari sampel lapangan menuju isolat kandidat yang siap diuji lebih lanjut. Alurnya dapat digambarkan sebagai berikut.

Rendering diagram...

Diagram tersebut menunjukkan bahwa isolasi mikroba adalah proses bertahap. Setiap tahap menghasilkan bahan atau data yang menjadi dasar bagi tahap berikutnya.

BAB 2. PENDAHULUAN

2.1 Dasar Pemikiran Isolasi Mikroba Lokal

Lahan pertanian yang sehat biasanya memiliki keragaman mikroba yang tinggi. Di sekitar akar tanaman terdapat zona yang disebut rizosfer, yaitu wilayah tanah yang sangat dipengaruhi oleh aktivitas akar. Pada zona ini, akar tanaman mengeluarkan berbagai senyawa organik yang dapat menjadi sumber energi bagi mikroba.

Karena itu, rizosfer sering menjadi lokasi yang kaya mikroba bermanfaat. Beberapa mikroba dapat membantu tanaman memperoleh unsur hara, sementara yang lain dapat bersaing dengan patogen tanaman. Selain rizosfer, kompos matang dan serasah sehat juga menjadi sumber penting karena mengandung mikroba dekomposer, jamur antagonis, dan bakteri lingkungan yang telah beradaptasi dengan bahan organik.

Namun, tidak semua mikroba dari sumber tersebut otomatis bermanfaat. Prosedur isolasi dibutuhkan agar mikroba yang diperoleh dapat dipisahkan satu per satu, diamati cirinya, diuji fungsinya, dan dipilih yang paling potensial.

2.2 Perbedaan Fokus PGPM dan APH

Walaupun sering berasal dari sumber sampel yang sama, PGPM dan APH memiliki fokus fungsi yang berbeda.

Rendering diagram...

Dalam praktiknya, satu isolat dapat memiliki lebih dari satu fungsi. Misalnya, isolat Bacillus tertentu dapat berperan sebagai PGPM karena mendukung pertumbuhan akar, sekaligus sebagai APH karena mampu menekan jamur patogen tanaman. Karena itu, uji fungsi menjadi tahap penting dalam proses seleksi.

2.3 Mengapa Prosedur Harus Bertahap

Proses isolasi tidak bisa dilakukan secara acak. Setiap tahap memiliki tujuan yang spesifik.

Tahap pengambilan sampel memastikan sumber mikroba berasal dari bahan yang aman dan relevan. Tahap suspensi dan pengenceran bertujuan membuat mikroba tersebar merata dan tidak terlalu padat. Tahap penanaman pada media bertujuan menumbuhkan koloni yang dapat diamati. Tahap pemurnian bertujuan memisahkan mikroba menjadi isolat tunggal. Tahap uji fungsi membuktikan apakah isolat tersebut benar-benar memiliki manfaat.

Alur kerja ini penting karena kualitas isolat akhir sangat bergantung pada ketertiban proses sejak awal.

Rendering diagram...

2.4 Hubungan Tahapan Isolasi dengan Media

Media memiliki peran penting dalam proses isolasi. Setiap media digunakan untuk tujuan yang berbeda. Ada media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri umum, ada media untuk jamur, ada media untuk pelarut fosfat, ada media untuk Pseudomonas, dan ada pula media untuk penyimpanan isolat.

Dengan memahami fungsi media, proses isolasi menjadi lebih terarah. Kita tidak hanya menumbuhkan mikroba, tetapi menumbuhkan mikroba pada media yang sesuai dengan target seleksi.

Rendering diagram...

2.5 Posisi Pembuatan Media dalam Serial Prosedur

Bagian pembuatan media tidak berdiri sendiri. Media disiapkan untuk mendukung seluruh tahapan isolasi. Tanpa media yang sesuai, koloni tidak akan tumbuh dengan baik, fungsi mikroba sulit diamati, dan penyimpanan isolat menjadi tidak stabil.

Secara praktis, media digunakan dalam empat kelompok besar:

Larutan kerja awal, seperti NaCl steril 0,85%.
Media isolasi dan pemurnian, seperti NA, TSA, PDA, Pikovskaya, NBRIP, King’s B, Aleksandrov, dan Starch Casein Agar.
Media uji fungsi, seperti CAS Agar, media IAA, Ashby, N-free Malate, dan PDA untuk uji antagonis.
Media penyimpanan, seperti agar miring atau slant.

Rendering diagram...

2.6 Prinsip Keamanan dan Kelayakan Isolat

Karena isolat berasal dari lingkungan terbuka, semua mikroba yang diperoleh harus diperlakukan sebagai mikroba yang belum diketahui identitas dan sifatnya. Artinya, isolat tidak boleh langsung diaplikasikan ke lahan luas tanpa proses seleksi bertahap.

Sumber sampel harus dipilih dari bahan yang aman, seperti tanah rizosfer, akar sehat, kompos matang, dan serasah sehat. Hindari sumber seperti feses, bangkai, limbah tercemar, air got, atau bahan yang berbau busuk menyengat.

Isolat yang layak dikembangkan harus memenuhi beberapa prinsip:

berasal dari sumber aman,
dapat dimurnikan,
tumbuh stabil,
tidak berbau busuk,
tidak menurunkan daya kecambah,
memiliki fungsi PGPM atau APH yang terukur,
dapat disimpan dan ditumbuhkan ulang,
serta memberikan hasil positif pada uji awal tanaman.

2.7 Cara Menggunakan Panduan Ini

Panduan ini sebaiknya dibaca secara berurutan.

Pertama, pembaca memahami bagian pengantar dan pendahuluan ini untuk melihat gambaran besar proses isolasi mikroba. Setelah itu, pembaca dapat masuk ke serial utama yang terdiri dari delapan tahap isolasi. Masing-masing tahap menjelaskan tujuan, prinsip, alat, bahan, langkah kerja, kesalahan umum, dan output yang diharapkan.

Setelah delapan tahap selesai, bagian pembuatan media digunakan sebagai rujukan teknis untuk menyiapkan media yang diperlukan. Dengan cara ini, pembaca tidak hanya mengetahui langkah isolasi, tetapi juga memahami peran media dalam setiap fase proses.

Urutan pembacaan yang disarankan adalah sebagai berikut.

Rendering diagram...

2.8 Jembatan Menuju Serial Prosedur

Berdasarkan uraian di atas, proses isolasi mikroba PGPM dan APH dapat dipahami sebagai perjalanan dari sumber mikroba lokal menuju isolat kandidat yang siap diuji lanjut.

Tahap awal berfokus pada pengambilan dan pengenceran sampel. Tahap tengah berfokus pada penumbuhan, pengamatan, seleksi, dan pemurnian koloni. Tahap akhir berfokus pada uji fungsi, penyimpanan, pencatatan, dan uji awal tanaman.

Dengan kerangka tersebut, pembahasan berikutnya dapat langsung masuk ke bagian utama, yaitu:

Tahap 1. Pengambilan Sampel
Tahap 2. Pembuatan Suspensi Awal
Tahap 3. Pengenceran Bertingkat
Tahap 4. Penanaman pada Media
Tahap 5. Inkubasi dan Pertumbuhan Koloni
Tahap 6. Seleksi Koloni dan Pemurnian
Tahap 7. Uji Fungsi PGPM dan APH
Tahap 8. Kode Isolat, Penyimpanan, dan Uji Awal

Setelah delapan tahap tersebut, tulisan kemudian dilanjutkan dengan bagian:

Prosedur Pembuatan Media yang Digunakan dalam Proses Isolasi PGPM dan APH

Tahap 1: Pengambilan Sampel

Tujuan tahap ini

Tahap pertama bertujuan mendapatkan sumber mikroba lokal yang aman, representatif, dan berpeluang memiliki fungsi sebagai PGPM atau APH.

PGPM adalah Plant Growth Promoting Microorganisms, yaitu mikroba pemacu pertumbuhan tanaman. APH adalah Agen Pengendali Hayati, yaitu mikroba yang berpotensi menekan patogen tanaman.

Pada tahap ini, kualitas sampel sangat menentukan keberhasilan isolasi. Sampel yang baik biasanya berasal dari tanaman sehat, akar aktif, tanah rizosfer, kompos matang, atau bahan organik sehat.

1. Prinsip utama pengambilan sampel

Diagram Tahap 1 — Pengambilan Sampel

Rendering diagram...

Ambil sampel dari lokasi yang memiliki peluang tinggi menyimpan mikroba bermanfaat.

Untuk PGPM, pilih:

Tanaman yang tumbuh paling sehat
Tanaman dengan akar kuat
Tanaman dengan daun hijau, vigor bagus, dan pertumbuhan seragam
Lahan yang produktif
Area yang tidak terlalu sering memakai pestisida kimia berat

Untuk APH, pilih:

Tanaman sehat di lahan yang ada tekanan penyakit
Tanaman yang tetap sehat saat tanaman sekitarnya sakit
Rizosfer tanaman sehat dekat area serangan penyakit
Kompos matang yang stabil dan tidak berbau busuk

Prinsip praktisnya:

PGPM dicari dari tanaman yang tumbuh kuat. APH dicari dari tanaman sehat yang mampu bertahan di lingkungan berpenyakit.

2. Sumber sampel yang disarankan

✓ A. Tanah rizosfer

Rizosfer adalah tanah yang menempel atau berada sangat dekat dengan akar tanaman.

Ini adalah sumber utama untuk isolasi PGPM dan APH karena banyak mikroba aktif hidup di zona akar.

Cara mengambilnya:

Pilih tanaman sehat.
Gali perlahan sampai akar terlihat.
Ambil tanah yang menempel di sekitar akar.
Jangan ambil tanah terlalu jauh dari akar.
Masukkan ke plastik steril atau wadah steril.

Jumlah sampel yang disarankan: 10–20 gram per titik sampel.

✓ B. Akar sehat

Akar sehat dapat menjadi sumber mikroba yang hidup di permukaan akar atau di sekitar jaringan akar.

Pilih akar yang:

Tidak busuk
Tidak berlendir
Tidak berbau
Tidak berwarna hitam abnormal
Memiliki rambut akar aktif

Ambil potongan akar kecil, sekitar 1–3 cm, lalu simpan dalam plastik steril.

✓ C. Kompos matang

Kompos matang bisa menjadi sumber mikroba dekomposer, Bacillus, Trichoderma, dan mikroba antagonis lainnya.

Ciri kompos matang yang layak:

Berbau tanah
Tidak panas
Tidak berbau amonia tajam
Tidak berlendir
Warna cokelat gelap sampai hitam
Tekstur remah

Jangan ambil kompos yang masih panas, busuk, atau berbau menyengat.

✓ D. Serasah sehat

Serasah adalah daun, ranting kecil, atau bahan organik yang mulai lapuk secara alami.

Pilih serasah yang:

Tidak berbau busuk
Tidak tercemar limbah
Berasal dari kebun sehat
Tidak bercampur kotoran hewan

Serasah bisa digunakan untuk mencari jamur dekomposer atau calon APH seperti Trichoderma.

3. Sumber sampel yang harus dihindari

Jangan gunakan sampel dari:

Feses
Bangkai
Limbah rumah tangga
Limbah rumah sakit
Selokan
Air got
Sampah busuk
Tanah tercemar oli, pestisida berat, atau bahan kimia
Bahan yang berbau busuk menyengat

Alasannya: sumber tersebut berisiko membawa mikroba patogen, mikroba pembusuk, atau kontaminan yang tidak aman untuk dikembangkan.

4. Alat yang digunakan

Siapkan:

Alat	Fungsi
Sarung tangan	Mengurangi kontaminasi dari tangan
Sendok/spatula steril	Mengambil tanah, akar, atau kompos
Plastik steril / zip bag steril	Menyimpan sampel
Marker permanen	Memberi kode sampel
Alkohol 70%	Membersihkan alat kerja
Tisu steril / kain bersih	Membersihkan permukaan alat
Cooler box sederhana	Menjaga sampel tetap sejuk saat transportasi

Bila tidak ada plastik steril laboratorium, gunakan plastik zip baru yang bersih, lalu minimalkan sentuhan bagian dalam plastik.

5. Cara mengambil sampel tanah rizosfer

✓ Langkah kerja

Pilih tanaman sehat.
Bersihkan permukaan tanah dari daun kering berlebih.
Gali tanah perlahan sedalam sekitar 5–15 cm, tergantung jenis tanaman.
Temukan bagian akar aktif.
Ambil tanah yang menempel di akar atau tanah sekitar ±1–5 cm dari akar.
Masukkan sampel ke plastik steril.
Tutup plastik dengan rapat.
Beri label lengkap.

Untuk tanaman kecil seperti cabai, tomat, melon, pakcoy, selada, dan tanaman hortikultura lain, tanah rizosfer biasanya mudah diambil dari area sekitar perakaran aktif.

6. Cara mengambil sampel akar

Pilih akar muda yang sehat.
Potong akar kecil sepanjang 1–3 cm.
Jangan ambil akar yang busuk atau berlendir.
Masukkan ke wadah steril.
Beri label.

Untuk isolasi mikroba dari akar, sebaiknya akar tidak dicuci di lapangan. Pembersihan dilakukan nanti saat proses laboratorium.

7. Cara mengambil sampel kompos matang

Pilih tumpukan kompos yang sudah matang.
Ambil dari bagian tengah, bukan hanya permukaan.
Gunakan sendok atau spatula steril.
Ambil sekitar 10–20 gram.
Masukkan ke plastik steril.
Beri label.

Jika kompos masih panas, jangan digunakan untuk isolasi PGPM atau APH utama. Kompos panas menunjukkan proses dekomposisi belum stabil.

8. Cara mengambil sampel serasah

Pilih serasah dari area kebun sehat.
Ambil daun atau ranting yang mulai lapuk alami.
Hindari bagian yang berbau busuk.
Ambil sekitar 5–10 gram.
Masukkan ke plastik steril.
Beri label.

Serasah cocok untuk mencari mikroba dekomposer dan jamur antagonis tertentu.

9. Sistem pengambilan sampel yang lebih representatif

Untuk satu lahan, jangan hanya ambil dari satu titik.

Gunakan pola sederhana:

Ambil dari 5 titik tanaman sehat
Setiap titik ambil 10–20 gram
Bisa digabung menjadi satu sampel komposit, atau dipisah per titik

Untuk riset atau seleksi isolat yang lebih rapi, lebih baik dipisah per titik agar asal isolat bisa dilacak.

Contoh kode:

Kode sampel	Arti
RZ-CB-01	Rizosfer cabai titik 1
RZ-TM-01	Rizosfer tomat titik 1
KP-01	Kompos matang sampel 1
SR-01	Serasah sampel 1
AK-CB-01	Akar cabai titik 1

10. Format label sampel

Setiap sampel wajib diberi label.

Isi label minimal:

Kode sampel     :
Lokasi          :
Tanggal         :
Jenis tanaman   :
Jenis sampel    :
Kondisi tanaman :
Catatan lahan   :

Contoh:

Kode sampel     : RZ-CB-01
Lokasi          : Blok A, kebun cabai
Tanggal         : 12/05/2026
Jenis tanaman   : Cabai
Jenis sampel    : Tanah rizosfer
Kondisi tanaman : Sehat, vigor tinggi
Catatan lahan   : Sekitar tanaman lain ada layu ringan

11. Penyimpanan dan transportasi sampel

Setelah sampel diambil:

Simpan di tempat sejuk
Hindari sinar matahari langsung
Jangan dibiarkan dalam kendaraan panas
Jangan ditambah air
Jangan dicampur dengan bahan lain
Proses secepatnya, idealnya dalam 24 jam

Jika belum langsung diproses, simpan sementara pada suhu sejuk, misalnya dalam cooler box. Jangan dibekukan, karena pembekuan dapat menurunkan viabilitas sebagian mikroba.

12. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan umum pada tahap pengambilan sampel:

Mengambil tanah terlalu jauh dari akar
Mengambil sampel dari tanaman sakit parah
Sampel tidak diberi label
Plastik sampel terbuka terlalu lama
Alat tidak steril
Sampel terkena panas matahari
Sampel dicampur tanpa catatan asal
Mengambil kompos yang belum matang
Menggunakan sampel dari sumber berisiko seperti feses atau limbah

13. Output dari tahap 1

Hasil akhir dari tahap ini adalah sampel mikroba lokal siap diproses.

Output minimal:

Output	Keterangan
Sampel tanah rizosfer	Sumber utama PGPM dan APH
Sampel akar sehat	Sumber mikroba akar
Sampel kompos matang	Sumber dekomposer dan antagonis
Sampel serasah sehat	Sumber jamur dan dekomposer
Label sampel lengkap	Agar asal isolat dapat dilacak
Catatan lapangan	Membantu seleksi isolat terbaik

✓ Ringkasan Tahap 1

Pilih tanaman/lahan sehat → ambil tanah rizosfer, akar, kompos matang, atau serasah sehat → gunakan alat steril → hindari sumber berisiko → beri label lengkap → simpan sejuk → segera proses.

Tahap 2: Pembuatan Suspensi Awal

Tujuan tahap ini

Tahap 2 bertujuan memindahkan mikroba dari sampel padat ke dalam larutan steril, sehingga mikroba tersebar merata dan siap diencerkan pada tahap berikutnya.

Sampel seperti tanah rizosfer, akar, kompos, atau serasah masih berbentuk padat. Mikroba di dalamnya menempel pada partikel tanah, permukaan akar, bahan organik, atau serasah. Karena itu, sampel perlu dibuat menjadi suspensi awal.

Suspensi awal adalah campuran antara sampel dan larutan steril yang dikocok sampai mikroba tersebar di dalam cairan.

1. Prinsip dasar tahap 2

Pada tahap ini digunakan perbandingan:

1 gram sampel + 9 ml larutan NaCl steril 0,85%

Hasilnya disebut pengenceran awal 10⁻¹.

Artinya, sampel sudah diencerkan 10 kali dari kondisi awal.

✓ Diagram Tahap 2 — Pembuatan Suspensi Awal

Rendering diagram...

2. Definisi istilah penting

Istilah	Arti
NaCl	Natrium klorida, yaitu garam
NaCl steril 0,85%	Larutan garam steril dengan konsentrasi 0,85%
Suspensi	Campuran mikroba dalam cairan
Homogen	Tercampur merata
10⁻¹	Pengenceran 1 banding 10
Tabung steril	Tabung yang bebas mikroba kontaminan

Catatan penting: NaCl bukan chlorine aktif. NaCl adalah garam. Yang membunuh mikroba adalah chlorine aktif seperti kaporit, pemutih, atau sodium hypochlorite.

3. Bahan yang disiapkan

Untuk setiap sampel, siapkan:

Bahan	Jumlah
Sampel tanah rizosfer / akar / kompos / serasah	1 gram
Larutan NaCl steril 0,85%	9 ml
Tabung steril	1 buah
Pipet steril atau mikropipet	Sesuai kebutuhan
Spatula/sendok steril	1 buah
Label	1 buah
Marker permanen	1 buah

4. Cara membuat larutan NaCl steril 0,85%

Jika belum tersedia, larutan NaCl 0,85% dapat dibuat dengan rumus:

0,85 gram NaCl + 100 ml aquadest

Atau untuk volume lebih besar:

8,5 gram NaCl + 1 liter aquadest

Langkah membuatnya:

Timbang NaCl sesuai kebutuhan.
Larutkan ke dalam aquadest.
Aduk sampai larut sempurna.
Masukkan ke botol atau tabung.
Sterilkan dengan autoklaf bila tersedia.
Dinginkan sebelum digunakan.

Jika tidak ada autoklaf, gunakan larutan steril siap pakai dari laboratorium atau supplier. Untuk hasil isolasi yang rapi, sebaiknya jangan menggunakan air PAM langsung karena bisa mengandung chlorine.

5. Persiapan sebelum membuat suspensi

Sebelum sampel dimasukkan ke tabung:

Bersihkan meja kerja.
Semprot permukaan kerja dengan alkohol 70%.
Gunakan sarung tangan.
Siapkan tabung berisi 9 ml NaCl steril 0,85%.
Beri label pada tabung.
Pastikan kode tabung sama dengan kode sampel.

Contoh label:

RZ-CB-01 / 10⁻¹

Artinya:

RZ = rizosfer
CB = cabai
01 = sampel nomor 1
10⁻¹ = suspensi awal

6. Langkah kerja pembuatan suspensi awal

✓ Langkah 1 — Ambil 1 gram sampel

Ambil 1 gram sampel menggunakan spatula atau sendok steril.

Untuk sampel tanah rizosfer:

Ambil tanah yang dekat akar.
Hindari batu besar, akar kasar, atau sisa bahan yang terlalu besar.
Jika ada gumpalan besar, hancurkan perlahan secara steril.

Untuk sampel kompos:

Pilih bagian yang remah.
Hindari potongan kayu besar.
Jangan gunakan kompos yang masih panas atau berbau busuk.

Untuk sampel serasah:

Potong kecil-kecil secara steril.
Gunakan bagian yang lapuk sehat, bukan yang busuk.

Untuk sampel akar:

Potong kecil-kecil sekitar 0,5–1 cm.
Gunakan akar sehat, bukan akar busuk.
Jika akar masih banyak tanah, tanah yang menempel boleh ikut sebagai sumber mikroba rizosfer.

✓ Langkah 2 — Masukkan ke tabung berisi 9 ml NaCl steril

Masukkan 1 gram sampel ke dalam tabung yang sudah berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Pastikan sampel masuk ke dalam cairan, bukan menempel di dinding tabung bagian atas.

✓ Langkah 3 — Tutup tabung

Tutup tabung dengan rapat.

Tujuannya:

Mencegah kontaminasi dari udara
Mencegah larutan tumpah saat dikocok
Menjaga kondisi tetap steril

✓ Langkah 4 — Kocok sampai homogen

Kocok tabung selama 30–60 detik.

Jika tersedia alat vortex, gunakan vortex agar campuran lebih merata.

Jika tidak ada vortex, kocok manual dengan gerakan kuat namun hati-hati.

Tujuannya:

Melepaskan mikroba dari partikel tanah
Menyebarkan mikroba ke dalam larutan
Membuat suspensi menjadi lebih merata
Menghasilkan pengenceran awal 10⁻¹

7. Hasil akhir tahap 2

Setelah dikocok, isi tabung akan tampak seperti campuran keruh.

Untuk tanah rizosfer, biasanya larutan menjadi cokelat keruh.

Untuk kompos, larutan bisa lebih gelap.

Untuk akar atau serasah, mungkin ada potongan kecil bahan organik di dalam tabung.

Itu normal, selama sampel berasal dari sumber aman dan tidak berbau busuk.

Hasil tahap ini disebut:

Suspensi awal 10⁻¹

8. Fungsi NaCl steril 0,85%

Larutan NaCl steril 0,85% memiliki beberapa fungsi:

Fungsi	Penjelasan
Menjaga kestabilan sel mikroba	Mikroba tidak terlalu stres akibat perbedaan tekanan osmotik
Membantu pelepasan mikroba	Mikroba lebih mudah terlepas dari tanah, akar, atau kompos
Membuat sampel mudah diencerkan	Suspensi cair lebih mudah dipindahkan dengan pipet
Mengurangi risiko kontaminasi	Karena larutan sudah steril
Menjadi dasar pengenceran bertingkat	Dari 10⁻¹ dilanjutkan ke 10⁻² sampai 10⁻⁶

9. Kenapa harus 1 gram + 9 ml?

Karena kombinasi tersebut menghasilkan pengenceran 1 banding 10.

Perhitungannya:

Total campuran = 1 gram sampel + 9 ml larutan
Total ≈ 10 bagian

Maka:

1 bagian sampel dalam total 10 bagian = 10⁻¹

Itulah sebabnya tahap ini disebut pengenceran awal 10⁻¹.

10. Catatan untuk berbagai jenis sampel

✓ A. Tanah rizosfer

Ini sampel paling umum dan paling mudah diproses.

Gunakan:

1 gram tanah rizosfer + 9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai tanah terdispersi merata.

✓ B. Kompos matang

Gunakan kompos matang yang remah.

Jika kompos terlalu kasar:

Pilih bagian halus.
Ambil 1 gram.
Masukkan ke 9 ml NaCl steril.
Kocok kuat.

Kompos biasanya menghasilkan suspensi lebih gelap.

✓ C. Serasah sehat

Untuk serasah:

Potong kecil-kecil.
Timbang 1 gram.
Masukkan ke 9 ml NaCl steril.
Kocok lebih lama, sekitar 1–2 menit.

Karena mikroba sering menempel kuat pada permukaan bahan organik.

✓ D. Akar sehat

Untuk akar:

Potong kecil akar sehat.
Timbang 1 gram.
Masukkan ke 9 ml NaCl steril.
Kocok atau vortex.

Jika targetnya mikroba sekitar akar, tanah yang menempel pada akar masih bisa ikut. Jika targetnya mikroba permukaan akar, gunakan akar yang masih segar dan sehat.

11. Kontrol kebersihan

Pada tahap ini sebaiknya siapkan satu tabung kontrol:

9 ml NaCl steril tanpa sampel

Tabung ini tidak diberi sampel.

Fungsinya untuk mengecek apakah larutan NaCl atau tabung sudah terkontaminasi.

Jika nanti kontrol ikut tumbuh mikroba, berarti ada masalah pada sterilitas larutan, tabung, atau teknik kerja.

12. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Sampel tidak ditimbang 1 gram	Konsentrasi tidak konsisten
Larutan bukan 9 ml	Pengenceran tidak tepat
Tabung tidak steril	Kontaminasi
Sampel tidak dikocok	Mikroba tidak tersebar merata
Menggunakan air PAM langsung	Risiko chlorine dan kontaminan
Tidak memberi label	Sampel tertukar
Menggunakan sampel busuk	Risiko mikroba tidak aman
Mengambil bagian yang terlalu kasar	Suspensi sulit homogen

13. Indikator tahap 2 berhasil

Tahap ini dianggap berhasil jika:

Tabung sudah berlabel jelas
Sampel masuk seluruhnya ke larutan
Suspensi tampak merata setelah dikocok
Tidak ada bau busuk menyengat
Tidak ada kesalahan kode sampel
Suspensi siap digunakan untuk pengenceran berikutnya

14. Output tahap 2

Output dari tahap ini adalah:

Tabung suspensi awal 10⁻¹

Contoh pencatatan:

Kode sampel	Jenis sampel	Larutan	Status
RZ-CB-01	Rizosfer cabai	NaCl steril 0,85%	Suspensi 10⁻¹ siap
KP-01	Kompos matang	NaCl steril 0,85%	Suspensi 10⁻¹ siap
AK-TM-01	Akar tomat sehat	NaCl steril 0,85%	Suspensi 10⁻¹ siap

✓ Ringkasan Tahap 2

Ambil 1 gram sampel → masukkan ke 9 ml NaCl steril 0,85% → tutup tabung → kocok 30–60 detik sampai homogen → hasilnya adalah suspensi awal 10⁻¹.

Tahap 3: Pengenceran Bertingkat

✓ Tujuan tahap ini

Tahap 3 bertujuan menurunkan jumlah mikroba secara bertahap agar saat ditanam pada media agar, koloni tidak tumbuh terlalu padat dan dapat dipisahkan satu per satu.

Pada tahap sebelumnya, kita sudah punya suspensi awal 10⁻¹, yaitu:

1 gram sampel + 9 ml NaCl steril 0,85%

Suspensi 10⁻¹ ini masih mengandung mikroba dalam jumlah sangat banyak. Jika langsung ditanam ke media agar, kemungkinan besar koloni akan tumbuh menumpuk dan sulit dipilih. Karena itu perlu dibuat pengenceran lanjutan sampai 10⁻⁶.

1. Prinsip pengenceran bertingkat

Pengenceran bertingkat dilakukan dengan pola:

1 ml suspensi sebelumnya + 9 ml NaCl steril 0,85%

Setiap perpindahan akan menurunkan kepadatan mikroba 10 kali lipat.

Contoh:

10⁻¹ → 10⁻² → 10⁻³ → 10⁻⁴ → 10⁻⁵ → 10⁻⁶

Artinya, semakin besar angka pangkat negatifnya, semakin encer jumlah mikroba di dalam larutan.

✓ Diagram Tahap 3 — Pengenceran Bertingkat

Rendering diagram...

2. Definisi sederhana

Istilah	Arti
10⁻¹	Pengenceran 1 banding 10
10⁻²	Pengenceran 1 banding 100
10⁻³	Pengenceran 1 banding 1.000
10⁻⁴	Pengenceran 1 banding 10.000
10⁻⁵	Pengenceran 1 banding 100.000
10⁻⁶	Pengenceran 1 banding 1.000.000

Semakin encer, koloni yang tumbuh di media agar akan semakin sedikit dan lebih mudah dipisahkan.

3. Alat dan bahan

Siapkan untuk setiap sampel:

Alat/Bahan	Jumlah
Suspensi awal 10⁻¹	1 tabung
Tabung steril	5 tabung
NaCl steril 0,85%	9 ml per tabung
Pipet steril / mikropipet	Sesuai kebutuhan
Tips pipet steril	Beberapa buah
Rak tabung	1 buah
Marker permanen	1 buah
Alkohol 70%	Untuk menjaga kebersihan area kerja

Karena tabung 10⁻¹ sudah dibuat pada tahap 2, pada tahap ini kita menyiapkan tabung tambahan untuk:

10⁻²
10⁻³
10⁻⁴
10⁻⁵
10⁻⁶

4. Persiapan tabung

Siapkan 5 tabung steril, masing-masing diisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Lalu beri label:

10⁻²
10⁻³
10⁻⁴
10⁻⁵
10⁻⁶

Jika sampelnya banyak, label harus lebih lengkap.

Contoh:

RZ-CB-01 / 10⁻²
RZ-CB-01 / 10⁻³
RZ-CB-01 / 10⁻⁴
RZ-CB-01 / 10⁻⁵
RZ-CB-01 / 10⁻⁶

Jangan hanya menulis angka pengenceran tanpa kode sampel, karena tabung mudah tertukar.

5. Langkah kerja pengenceran bertingkat

✓ Langkah 1 — Homogenkan tabung 10⁻¹

Sebelum diambil, kocok dulu tabung 10⁻¹ selama beberapa detik.

Tujuannya agar mikroba tersebar merata di dalam larutan.

Jangan mengambil cairan dari tabung yang belum dikocok, karena mikroba bisa mengendap bersama partikel tanah.

✓ Langkah 2 — Buat pengenceran 10⁻²

Ambil:

1 ml dari tabung 10⁻¹

Masukkan ke tabung baru berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai homogen.

Hasilnya adalah:

Pengenceran 10⁻²

✓ Langkah 3 — Buat pengenceran 10⁻³

Kocok dulu tabung 10⁻².

Ambil:

1 ml dari tabung 10⁻²

Masukkan ke tabung baru berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai homogen.

Hasilnya adalah:

Pengenceran 10⁻³

✓ Langkah 4 — Buat pengenceran 10⁻⁴

Kocok dulu tabung 10⁻³.

Ambil:

1 ml dari tabung 10⁻³

Masukkan ke tabung baru berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai homogen.

Hasilnya adalah:

Pengenceran 10⁻⁴

✓ Langkah 5 — Buat pengenceran 10⁻⁵

Kocok dulu tabung 10⁻⁴.

Ambil:

1 ml dari tabung 10⁻⁴

Masukkan ke tabung baru berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai homogen.

Hasilnya adalah:

Pengenceran 10⁻⁵

✓ Langkah 6 — Buat pengenceran 10⁻⁶

Kocok dulu tabung 10⁻⁵.

Ambil:

1 ml dari tabung 10⁻⁵

Masukkan ke tabung baru berisi:

9 ml NaCl steril 0,85%

Kocok sampai homogen.

Hasilnya adalah:

Pengenceran 10⁻⁶

6. Ringkasan dalam tabel

Tabung	Cara membuat	Hasil
10⁻¹	1 g sampel + 9 ml NaCl steril	Suspensi awal
10⁻²	1 ml dari 10⁻¹ + 9 ml NaCl steril	100 kali lebih encer dari sampel awal
10⁻³	1 ml dari 10⁻² + 9 ml NaCl steril	1.000 kali lebih encer
10⁻⁴	1 ml dari 10⁻³ + 9 ml NaCl steril	10.000 kali lebih encer
10⁻⁵	1 ml dari 10⁻⁴ + 9 ml NaCl steril	100.000 kali lebih encer
10⁻⁶	1 ml dari 10⁻⁵ + 9 ml NaCl steril	1.000.000 kali lebih encer

7. Diagram alur sederhana

10⁻¹
  ↓ ambil 1 ml + 9 ml NaCl steril
10⁻²
  ↓ ambil 1 ml + 9 ml NaCl steril
10⁻³
  ↓ ambil 1 ml + 9 ml NaCl steril
10⁻⁴
  ↓ ambil 1 ml + 9 ml NaCl steril
10⁻⁵
  ↓ ambil 1 ml + 9 ml NaCl steril
10⁻⁶

Setiap tahap wajib dikocok sebelum dipindahkan ke tabung berikutnya.

8. Mengapa harus dikocok setiap tahap?

Mikroba tidak selalu tersebar merata. Sebagian bisa menempel pada partikel kecil, sebagian bisa mengendap, dan sebagian berada di permukaan cairan.

Jika tabung tidak dikocok:

Jumlah mikroba yang terambil bisa tidak akurat
Hasil pengenceran tidak konsisten
Koloni yang tumbuh bisa terlalu padat atau terlalu sedikit
Perbandingan antar isolat menjadi kurang valid

Karena itu, aturan pentingnya:

Kocok dulu → ambil 1 ml → pindahkan → kocok lagi

9. Pengenceran mana yang nanti ditanam?

Untuk isolasi mikroba pemacu pertumbuhan tanaman dan agen pengendali hayati, biasanya yang ditanam ke media agar adalah:

10⁻³
10⁻⁴
10⁻⁵
10⁻⁶

Alasannya:

10⁻¹ dan 10⁻² sering masih terlalu pekat
10⁻³ sampai 10⁻⁶ lebih berpeluang menghasilkan koloni terpisah
Koloni terpisah lebih mudah dipilih untuk dimurnikan

Namun pemilihan pengenceran juga tergantung jenis sampel.

10. Rekomendasi pengenceran berdasarkan jenis sampel

Jenis sampel	Pengenceran yang disarankan untuk ditanam
Tanah rizosfer	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶
Kompos matang	10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶
Serasah sehat	10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴
Akar sehat	10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴
Tanah sangat subur/organik tinggi	10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶

Untuk sampel yang kaya mikroba seperti kompos, gunakan pengenceran lebih tinggi karena jumlah mikrobanya biasanya sangat padat.

11. Rekomendasi pengenceran berdasarkan target mikroba

Target mikroba	Pengenceran yang sering dipakai
Bakteri umum	10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶
Bakteri pelarut fosfat	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Bakteri pelarut kalium	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Bacillus	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Pseudomonas fluorescens	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Trichoderma	10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴
Streptomyces	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Yeast/khamir	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵

12. Aturan penting agar tidak kontaminasi

Beberapa aturan kerja yang harus dijaga:

Gunakan tabung steril.
Gunakan NaCl steril 0,85%.
Ganti tips pipet setiap perpindahan.
Jangan memasukkan tips bekas ke tabung lain.
Jangan menyentuh bagian dalam tutup tabung.
Jangan membuka tabung terlalu lama.
Selalu kocok tabung sebelum mengambil cairan.
Beri label sebelum mulai bekerja.
Kerjakan dekat api bunsen atau di ruang kerja bersih jika tersedia.
Buang tips bekas ke wadah limbah yang aman.

13. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Tidak mengganti tips pipet	Pengenceran silang dan hasil tidak valid
Tabung tidak dikocok	Mikroba tidak merata
Salah label tabung	Data isolat kacau
Mengambil lebih/kurang dari 1 ml	Tingkat pengenceran tidak tepat
Volume NaCl tidak 9 ml	Pengenceran berubah
Tabung terlalu lama terbuka	Kontaminasi udara
Menanam dari pengenceran terlalu pekat	Koloni menyatu
Menanam dari pengenceran terlalu encer	Koloni terlalu sedikit

14. Contoh pencatatan tahap 3

Gunakan tabel sederhana seperti ini:

Kode sampel	Pengenceran	Volume diambil	Pengencer	Keterangan
RZ-CB-01	10⁻²	1 ml dari 10⁻¹	9 ml NaCl steril	Homogen
RZ-CB-01	10⁻³	1 ml dari 10⁻²	9 ml NaCl steril	Homogen
RZ-CB-01	10⁻⁴	1 ml dari 10⁻³	9 ml NaCl steril	Homogen
RZ-CB-01	10⁻⁵	1 ml dari 10⁻⁴	9 ml NaCl steril	Homogen
RZ-CB-01	10⁻⁶	1 ml dari 10⁻⁵	9 ml NaCl steril	Homogen

15. Output tahap 3

Hasil akhir tahap ini adalah satu rangkaian tabung pengenceran:

10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶

Tabung yang paling sering dilanjutkan ke tahap penanaman media adalah:

10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, dan 10⁻⁶

✓ Ringkasan Tahap 3

Kocok tabung 10⁻¹ → ambil 1 ml → masukkan ke 9 ml NaCl steril untuk membuat 10⁻² → kocok → ulangi pola yang sama sampai 10⁻⁶.

Tahap 4: Penanaman pada Media

✓ Tujuan tahap ini

Tahap 4 bertujuan menumbuhkan mikroba dari hasil pengenceran pada media agar yang sesuai, sehingga koloni dapat tumbuh terpisah dan mudah dipilih pada tahap berikutnya.

Pada tahap sebelumnya sudah tersedia tabung pengenceran:

10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶

Untuk penanaman pada media, biasanya digunakan pengenceran:

10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, dan 10⁻⁶

Karena pada pengenceran tersebut jumlah mikroba sudah lebih rendah, sehingga peluang mendapatkan koloni yang terpisah lebih besar.

tahap-4-isolasi-mikroba

1. Prinsip penanaman pada media

Prinsipnya sederhana:

Ambil 0,1 ml suspensi hasil pengenceran
↓
Teteskan ke permukaan media agar
↓
Sebarkan merata
↓
Tutup cawan
↓
Labeli
↓
Siap diinkubasi

Volume 0,1 ml sama dengan 100 mikroliter.

Volume ini umum dipakai karena cukup untuk menyebarkan mikroba di permukaan agar tanpa membuat media terlalu basah.

✓ Diagram Tahap 4 — Penanaman pada Media

Rendering diagram...

2. Definisi istilah penting

Istilah	Arti
Media agar	Media padat untuk menumbuhkan mikroba
Cawan petri	Wadah bundar untuk media agar
Koloni	Kumpulan mikroba yang tumbuh dan terlihat sebagai titik/bercak
Spread plate	Metode menanam mikroba dengan cara menyebarkan suspensi di permukaan agar
Spreader	Alat steril untuk meratakan suspensi di permukaan agar
0,1 ml	Volume suspensi yang ditanam, sama dengan 100 mikroliter
Kontrol negatif	Media tanpa sampel untuk memastikan media tidak terkontaminasi

3. Media yang digunakan

Pemilihan media tergantung target mikroba.

✓ A. NA / TSA untuk bakteri umum

NA adalah Nutrient Agar. TSA adalah Tryptic Soy Agar.

Keduanya digunakan untuk menumbuhkan bakteri umum dari tanah, rizosfer, akar, dan kompos.

Cocok untuk isolasi awal:

Bacillus
Bakteri rizosfer umum
Calon mikroba pemacu pertumbuhan tanaman
Calon bakteri antagonis

Perbedaan praktis:

Media	Keterangan
NA	Lebih sederhana, murah, cocok untuk isolasi awal
TSA	Lebih kaya nutrisi, pertumbuhan bakteri biasanya lebih kuat

Untuk pekerjaan awal, NA sudah cukup.

✓ B. Pikovskaya / NBRIP untuk bakteri pelarut fosfat

Pikovskaya Agar dan NBRIP Agar digunakan untuk mencari bakteri pelarut fosfat.

Bakteri pelarut fosfat adalah mikroba yang membantu melarutkan fosfat tidak larut sehingga lebih mudah tersedia bagi tanaman.

Tanda positif pada media:

Ada zona bening di sekitar koloni

Zona bening menunjukkan adanya aktivitas pelarutan fosfat.

Keterangan:

Media	Fungsi
Pikovskaya Agar	Media klasik untuk seleksi pelarut fosfat
NBRIP Agar	Media seleksi pelarut fosfat dengan zona bening yang sering lebih jelas

✓ C. PDA / TSM untuk jamur dan Trichoderma

PDA adalah Potato Dextrose Agar. TSM adalah Trichoderma Selective Medium.

Keduanya digunakan untuk menumbuhkan jamur.

Media	Fungsi
PDA	Media umum untuk jamur
TSM	Media selektif untuk Trichoderma

Jika targetnya jamur umum atau Trichoderma dari kompos, tanah, atau serasah, gunakan PDA untuk isolasi awal. Jika ingin lebih spesifik mencari Trichoderma, gunakan TSM bila tersedia.

Ciri awal Trichoderma:

Tumbuh cepat
Awalnya putih
Kemudian berubah hijau
Tekstur seperti kapas atau tepung
Tidak berbau busuk

4. Media tambahan bila target lebih spesifik

Selain media pada gambar, beberapa media lain bisa digunakan bila target mikroba lebih spesifik.

Target	Media yang digunakan
Bakteri pelarut kalium	Aleksandrov Agar
Pseudomonas fluorescens	King’s B Agar
Streptomyces	Starch Casein Agar
Yeast/khamir rizosfer	YMEA atau PDA
Bacillus	NA atau TSA, sering didahului perlakuan panas ringan pada suspensi

Namun untuk tahap dasar, cukup mulai dari:

NA/TSA
Pikovskaya/NBRIP
PDA/TSM

5. Persiapan sebelum penanaman

Sebelum mulai, siapkan:

Alat/Bahan	Fungsi
Cawan petri berisi media agar	Tempat mikroba ditumbuhkan
Tabung pengenceran 10⁻³ sampai 10⁻⁶	Sumber mikroba
Mikropipet atau pipet steril	Mengambil 0,1 ml suspensi
Tips pipet steril	Mencegah kontaminasi silang
Spreader steril	Meratakan suspensi
Alkohol 70%	Membersihkan area kerja
Marker permanen	Memberi label cawan
Bunsen / area kerja bersih	Mengurangi kontaminasi udara

Pastikan media agar sudah padat, tidak terlalu basah, dan tidak ada kontaminasi sebelum digunakan.

6. Label cawan sebelum ditanam

Labeli bagian bawah cawan, bukan tutupnya.

Isi label minimal:

Kode sampel
Pengenceran
Jenis media
Tanggal tanam
Target mikroba

Contoh label:

RZ-CB-01 / 10⁻⁴ / NA / 12-05-2026

Artinya:

RZ-CB-01 = sampel rizosfer cabai nomor 1
10⁻⁴ = pengenceran yang ditanam
NA = Nutrient Agar
12-05-2026 = tanggal penanaman

Contoh untuk media lain:

RZ-CB-01 / 10⁻⁴ / Pikovskaya / PSB

KP-01 / 10⁻³ / PDA / Jamur

7. Pengenceran yang dipilih untuk ditanam

Umumnya gunakan:

10⁻³
10⁻⁴
10⁻⁵
10⁻⁶

Rekomendasi praktis:

Target	Pengenceran yang ditanam
Bakteri umum pada NA/TSA	10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶
Bakteri pelarut fosfat pada Pikovskaya/NBRIP	10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
Jamur pada PDA/TSM	10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴
Trichoderma dari kompos	10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴
Kompos matang yang sangat kaya mikroba	10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶

Jika belum tahu kepadatan mikroba sampel, tanam beberapa pengenceran sekaligus agar peluang mendapatkan koloni terpisah lebih besar.

8. Langkah kerja metode spread plate

✓ Langkah 1 — Homogenkan tabung pengenceran

Sebelum mengambil suspensi, kocok dulu tabung pengenceran.

Contoh:

Tabung 10⁻⁴ dikocok dulu sebelum diambil 0,1 ml

Tujuannya agar mikroba tersebar merata dan tidak hanya mengendap di bawah tabung.

✓ Langkah 2 — Ambil 0,1 ml suspensi

Ambil:

0,1 ml dari tabung pengenceran terpilih

Gunakan pipet steril atau mikropipet dengan tips steril.

Contoh:

0,1 ml dari 10⁻⁴

Jangan memakai tips yang sama untuk pengenceran berbeda.

✓ Langkah 3 — Teteskan ke media agar

Buka cawan petri secukupnya saja.

Teteskan suspensi ke permukaan agar.

Jangan menyentuhkan ujung pipet ke permukaan agar.

Setelah diteteskan, segera tutup kembali cawan untuk mengurangi kontaminasi.

✓ Langkah 4 — Sebarkan dengan spreader steril

Gunakan spreader steril untuk meratakan suspensi.

Gerakkan spreader perlahan di seluruh permukaan agar.

Pola penyebaran:

Gerakan memutar
Gerakan kanan-kiri
Gerakan menyilang

Tujuannya agar suspensi tersebar merata dan koloni tumbuh terpisah.

✓ Langkah 5 — Tunggu cairan meresap

Setelah disebar, biarkan cawan tertutup selama beberapa menit sampai permukaan agar tidak terlalu basah.

Jangan langsung membalik cawan jika masih ada cairan menggenang.

Cawan yang terlalu basah dapat menyebabkan koloni menyebar dan menyatu.

✓ Langkah 6 — Balik cawan

Setelah cairan meresap, cawan dapat dibalik.

Posisi inkubasi biasanya:

Media di atas
Tutup cawan di bawah

Tujuannya agar embun tidak menetes ke permukaan agar.

Namun jika permukaan masih terlalu basah, tunggu dulu sampai cairan terserap.

9. Jumlah cawan yang disarankan

Untuk hasil yang rapi, gunakan minimal duplikasi.

Contoh sederhana untuk satu sampel:

Media	Pengenceran	Jumlah cawan
NA	10⁻⁴	1 cawan
NA	10⁻⁵	1 cawan
NA	10⁻⁶	1 cawan
Pikovskaya	10⁻³	1 cawan
Pikovskaya	10⁻⁴	1 cawan
Pikovskaya	10⁻⁵	1 cawan
PDA	10⁻²	1 cawan
PDA	10⁻³	1 cawan
PDA	10⁻⁴	1 cawan

Jika sumber daya terbatas, gunakan pengenceran prioritas:

NA         : 10⁻⁵
Pikovskaya : 10⁻⁴
PDA        : 10⁻³

10. Kontrol negatif

Siapkan minimal satu cawan kontrol untuk setiap jenis media.

Cara membuat kontrol negatif:

Teteskan 0,1 ml NaCl steril tanpa sampel ke media agar
Sebarkan seperti sampel biasa
Inkubasi bersama cawan lain

Fungsi kontrol negatif:

Mengecek apakah media steril
Mengecek apakah NaCl steril benar-benar bersih
Mengecek apakah teknik penanaman menyebabkan kontaminasi

Jika kontrol negatif tumbuh mikroba, berarti ada kontaminasi pada media, larutan, alat, atau proses kerja.

11. Penanaman berdasarkan target PGPM

PGPM adalah mikroba pemacu pertumbuhan tanaman.

Target awal yang umum:

✓ A. Bakteri umum calon PGPM

Media:

NA atau TSA

Ambil dari pengenceran:

10⁻⁴, 10⁻⁵, atau 10⁻⁶

Koloni yang nanti dicari:

Tumbuh terpisah
Bentuk jelas
Tidak berbau busuk
Warna dan tekstur beragam
Mudah dimurnikan

✓ B. Bakteri pelarut fosfat

Media:

Pikovskaya atau NBRIP

Ambil dari pengenceran:

10⁻³, 10⁻⁴, atau 10⁻⁵

Koloni yang nanti dicari:

Koloni dengan zona bening di sekelilingnya

Semakin jelas zona bening, semakin menarik untuk diuji lanjut.

✓ C. Bakteri pelarut kalium

Jika menggunakan media Aleksandrov Agar, ambil dari:

10⁻³, 10⁻⁴, atau 10⁻⁵

Koloni positif biasanya memiliki zona bening di sekitar koloni.

12. Penanaman berdasarkan target APH

APH adalah agen pengendali hayati, yaitu mikroba yang berpotensi menekan patogen tanaman.

Target awal yang umum:

✓ A. Trichoderma

Media:

PDA atau TSM

Pengenceran:

10⁻², 10⁻³, atau 10⁻⁴

Koloni awal yang dicari:

Tumbuh cepat
Miselium putih di awal
Berubah hijau setelah beberapa hari
Tidak berlendir
Tidak berbau busuk

✓ B. Bacillus

Media:

NA atau TSA

Pengenceran:

10⁻³, 10⁻⁴, atau 10⁻⁵

Jika ingin memperkaya Bacillus, suspensi dapat diberi perlakuan panas ringan sebelum ditanam karena Bacillus membentuk spora yang relatif tahan.

Koloni awal yang dicari:

Warna putih, krem, atau kekuningan
Permukaan agak kering
Tepi bisa rata atau tidak beraturan
Tumbuh cukup cepat

✓ C. Pseudomonas fluorescens

Media:

King’s B Agar

Pengenceran:

10⁻³, 10⁻⁴, atau 10⁻⁵

Koloni awal yang dicari:

Tumbuh baik
Beberapa isolat menunjukkan fluoresensi kehijauan di bawah UV
Tidak berbau busuk

✓ D. Streptomyces

Media:

Starch Casein Agar

Pengenceran:

10⁻³, 10⁻⁴, atau 10⁻⁵

Koloni awal yang dicari:

Kering
Bertepung
Berbau tanah
Tumbuh lebih lambat dibanding bakteri umum

13. Teknik kerja steril saat menanam

Prinsip kerja steril sangat penting.

Lakukan hal berikut:

Bersihkan meja dengan alkohol 70%.
Jangan berbicara langsung di atas cawan terbuka.
Buka cawan hanya sebentar.
Jangan menyentuh permukaan agar.
Ganti tips pipet setiap sampel dan setiap pengenceran.
Sterilkan spreader sebelum dipakai atau gunakan spreader sekali pakai steril.
Jangan menumpuk cawan terbuka.
Labeli cawan sebelum penanaman.
Pisahkan cawan bakteri dan jamur bila memungkinkan.
Buang limbah ke wadah yang aman.

14. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Tidak mengocok tabung sebelum diambil	Mikroba tidak merata
Mengambil lebih dari 0,1 ml	Media terlalu basah
Tidak menyebarkan suspensi merata	Koloni menumpuk di satu area
Tidak mengganti tips pipet	Kontaminasi silang
Cawan terlalu lama terbuka	Kontaminasi udara
Salah label media atau pengenceran	Data tidak valid
Menanam dari pengenceran terlalu pekat	Koloni menyatu
Menanam dari pengenceran terlalu encer	Koloni terlalu sedikit
Media agar basah berlebihan	Koloni menyebar dan sulit dipilih
Tidak memakai kontrol negatif	Sulit mengetahui sumber kontaminasi

15. Tanda penanaman yang baik

Penanaman dianggap baik bila:

Suspensi tersebar merata di permukaan agar
Tidak ada cairan menggenang
Cawan berlabel jelas
Media tidak rusak atau sobek
Tidak ada kontaminasi terlihat sebelum inkubasi
Pengenceran yang ditanam sesuai target
Kontrol negatif disiapkan
Cawan siap diinkubasi

16. Output tahap 4

Hasil akhir tahap ini adalah:

Cawan media yang sudah diinokulasi suspensi mikroba

Contoh output:

Kode cawan	Isi
RZ-CB-01 / 10⁻⁴ / NA	Calon bakteri umum PGPM/APH
RZ-CB-01 / 10⁻⁴ / Pikovskaya	Calon bakteri pelarut fosfat
KP-01 / 10⁻³ / PDA	Calon jamur/Trichoderma
RZ-CB-01 / kontrol / NA	Kontrol negatif

✓ Ringkasan Tahap 4

Kocok tabung pengenceran → ambil 0,1 ml → teteskan ke media agar → sebar merata dengan spreader steril → tutup cawan → beri label → siapkan kontrol negatif → lanjut ke inkubasi.

Tahap 5: Inkubasi dan Pertumbuhan Koloni

✓# Tujuan tahap ini

Tahap 5 bertujuan memberi waktu dan kondisi yang sesuai agar mikroba tumbuh menjadi koloni yang terlihat, sehingga dapat diamati, dibandingkan, dan dipilih pada tahap berikutnya.

Setelah suspensi mikroba ditanam pada media agar di Tahap 4, mikroba belum langsung terlihat. Mikroba perlu waktu untuk memperbanyak diri sampai membentuk koloni.

Koloni adalah kumpulan sel mikroba yang tumbuh pada satu titik di media agar dan tampak sebagai bercak, titik, lingkaran, kapas, tepung, atau lapisan tertentu.

1. Prinsip dasar inkubasi

Setelah cawan petri ditanami mikroba, cawan disimpan pada suhu dan durasi tertentu agar mikroba dapat tumbuh.

Prinsipnya:

Cawan sudah ditanam
↓
Cawan ditutup dan dilabeli
↓
Cawan diinkubasi
↓
Koloni tumbuh
↓
Koloni diamati
↓
Koloni siap diseleksi

Untuk isolasi mikroba pertanian, suhu inkubasi yang umum digunakan adalah suhu mesofilik sedang, bukan suhu tubuh manusia.

Rekomendasi umum:

Kelompok mikroba	Suhu inkubasi	Lama inkubasi
Bakteri umum PGPM / APH	28–30°C	24–72 jam
Bakteri pelarut fosfat	28–30°C	2–5 hari
Bacillus	28–30°C	24–72 jam
Pseudomonas rizosfer	28–30°C	24–72 jam
Jamur umum	25–28°C	3–7 hari
Trichoderma	25–28°C	3–5 hari
Streptomyces	28–30°C	5–10 hari

Catatan: hindari inkubasi pada 37°C untuk isolasi awal mikroba lingkungan, karena suhu tersebut lebih dekat dengan suhu tubuh manusia dan bisa meningkatkan peluang tumbuhnya mikroba yang tidak diinginkan dari sisi keamanan.

✓ Diagram Tahap 5 — Inkubasi dan Pertumbuhan Koloni

Rendering diagram...

2. Posisi cawan saat inkubasi

Cawan petri sebaiknya diinkubasi dalam posisi terbalik.

Artinya:

Bagian media agar berada di atas
Tutup cawan berada di bawah

Tujuannya:

Mengurangi tetesan embun ke permukaan media
Mencegah koloni menyebar karena air kondensasi
Menjaga bentuk koloni tetap jelas
Memudahkan pengamatan morfologi koloni

Namun, jika permukaan media masih terlalu basah setelah penanaman, tunggu beberapa menit sampai cairan terserap sebelum cawan dibalik.

3. Kondisi inkubasi untuk bakteri

Untuk bakteri calon PGPM dan APH, gunakan:

Suhu       : 28–30°C
Waktu      : 24–72 jam
Media umum : NA, TSA, Pikovskaya, NBRIP, Aleksandrov, King's B

Pada 24 jam pertama, koloni bakteri cepat tumbuh biasanya mulai terlihat sebagai titik kecil.

Pada 48 jam, koloni lebih jelas.

Pada 72 jam, koloni biasanya sudah cukup besar untuk diamati dan dipilih.

Contoh hasil yang diharapkan:

Media	Target	Tanda awal
NA / TSA	Bakteri umum	Koloni bulat, krem, putih, kuning, atau bening
Pikovskaya / NBRIP	Bakteri pelarut fosfat	Koloni dengan zona bening
Aleksandrov	Bakteri pelarut kalium	Koloni dengan zona bening
King’s B	Pseudomonas	Koloni halus, beberapa dapat fluoresen
NA/TSA setelah perlakuan panas	Bacillus	Koloni putih/krem, agak kering, tepi bisa tidak rata

4. Kondisi inkubasi untuk jamur

Untuk jamur calon APH seperti Trichoderma, gunakan:

Suhu       : 25–28°C
Waktu      : 3–7 hari
Media umum : PDA atau TSM

Jamur biasanya tumbuh lebih lambat dibanding bakteri, tetapi hifanya bisa menyebar lebih luas.

Ciri umum jamur:

Muncul benang halus atau miselium
Awalnya putih
Bisa berubah warna menjadi hijau, abu-abu, hitam, kuning, atau cokelat
Permukaan bisa seperti kapas, tepung, beludru, atau serbuk

Untuk Trichoderma, ciri awal yang sering dicari:

Pertumbuhan cepat
Miselium awal berwarna putih
Setelah beberapa hari berubah hijau
Permukaan seperti kapas lalu menjadi bertepung
Tidak berbau busuk

5. Kondisi inkubasi untuk Streptomyces

Streptomyces termasuk kelompok bakteri berfilamen yang pertumbuhannya lebih lambat.

Gunakan:

Suhu       : 28–30°C
Waktu      : 5–10 hari
Media umum : Starch Casein Agar

Ciri awal Streptomyces:

Koloni kering
Permukaan bertepung
Warna putih, abu-abu, krem, atau cokelat muda
Sering berbau tanah
Tumbuh lebih lambat daripada bakteri biasa

Streptomyces menarik sebagai calon APH karena banyak isolatnya mampu menghasilkan senyawa antimikroba, tetapi tetap perlu uji keamanan dan uji fungsi.

6. Jangan membuka cawan terlalu sering

Selama inkubasi, cawan sebaiknya tidak sering dibuka.

Alasannya:

Udara membawa spora jamur dan bakteri kontaminan
Cawan bisa terkontaminasi
Koloni asli bisa terganggu
Risiko paparan mikroba meningkat
Data menjadi tidak valid

Pengamatan awal cukup dilakukan dari luar cawan.

Jika perlu melihat lebih jelas, gunakan:

Lampu dari samping
Kaca pembesar
Kamera ponsel
Marker untuk menandai bagian bawah cawan

7. Pengamatan harian

Lakukan pengamatan setiap hari tanpa membuka cawan.

Catat:

Hari	Yang diamati
Hari ke-1	Ada/tidaknya koloni bakteri cepat tumbuh
Hari ke-2	Bentuk, warna, jumlah, dan kepadatan koloni
Hari ke-3	Koloni bakteri matang, awal pertumbuhan jamur
Hari ke-4–5	Jamur dan Trichoderma mulai jelas
Hari ke-6–7	Jamur lebih matang, warna spora terlihat
Hari ke-8–10	Streptomyces dan mikroba lambat tumbuh lebih terlihat

Untuk bakteri umum, biasanya seleksi bisa mulai dilakukan setelah 24–72 jam. Untuk jamur, seleksi biasanya mulai dilakukan setelah 3–7 hari.

8. Parameter koloni yang diamati

Amati morfologi koloni, yaitu ciri fisik koloni yang terlihat.

✓ A. Warna koloni

Catat warna utama koloni.

Contoh:

Putih
Krem
Kuning
Oranye
Hijau
Abu-abu
Cokelat
Bening

Warna dapat membantu membedakan isolat, tetapi belum cukup untuk identifikasi.

✓ B. Bentuk koloni

Bentuk koloni bisa berupa:

Bulat
Tidak beraturan
Berfilamen
Menyebar
Titik kecil
Bercabang

Koloni bakteri sering berbentuk bulat atau tidak beraturan. Koloni jamur sering berfilamen atau menyebar seperti kapas.

✓ C. Tepi koloni

Tepi koloni dapat diamati sebagai:

Rata
Bergelombang
Bergerigi
Bercabang
Berfilamen

Ciri tepi berguna untuk membedakan koloni yang tampak mirip.

✓ D. Elevasi koloni

Elevasi adalah bentuk permukaan koloni dari samping.

Contoh:

Datar
Cembung
Timbul
Seperti kubah
Tidak rata

Koloni Bacillus sering tampak agak kering dan bisa tidak rata. Koloni Pseudomonas sering tampak halus dan mengilap.

✓ E. Tekstur koloni

Tekstur koloni bisa berupa:

Licin
Berlendir
Kering
Kasar
Bertepung
Seperti kapas
Beludru

Untuk APH jamur, tekstur sangat penting. Trichoderma sering tampak seperti kapas pada awalnya, lalu menjadi hijau bertepung.

✓ F. Ukuran koloni

Catat ukuran koloni secara sederhana:

Kecil
Sedang
Besar

Atau lebih rapi dengan ukuran diameter:

1 mm
2 mm
5 mm
10 mm

Ukuran membantu melihat kecepatan pertumbuhan.

9. Contoh format pencatatan koloni

Gunakan tabel sederhana.

Kode cawan	Media	Pengenceran	Hari	Ciri koloni dominan	Catatan
RZ-CB-01	NA	10⁻⁵	2	Koloni krem bulat, tepi rata	Banyak koloni terpisah
RZ-CB-01	Pikovskaya	10⁻⁴	3	Koloni kecil dengan zona bening	Calon pelarut fosfat
KP-01	PDA	10⁻³	4	Jamur putih-hijau tumbuh cepat	Calon Trichoderma
RZ-CB-01	King’s B	10⁻⁴	2	Koloni halus kekuningan	Perlu cek fluoresensi

10. Ciri cawan yang baik untuk seleksi

Cawan yang baik untuk tahap seleksi memiliki ciri:

Koloni tumbuh terpisah
Tidak terlalu padat
Tidak tertutup jamur kontaminan menyebar
Koloni punya bentuk yang jelas
Media tidak terlalu basah
Label lengkap
Kontrol negatif tetap bersih

Cawan yang ideal biasanya berisi koloni yang cukup banyak tetapi masih dapat dipilih satu per satu.

Secara praktis, pilih cawan yang:

Tidak kosong
Tidak terlalu padat
Koloni terpisah jelas

11. Ciri cawan yang kurang baik

Cawan kurang baik bila:

Kondisi	Masalah
Semua permukaan penuh mikroba	Pengenceran terlalu pekat
Koloni menyatu	Sulit dimurnikan
Ada cairan mengalir	Media terlalu basah
Jamur cepat menutup seluruh cawan	Koloni lain tertutup
Kontrol negatif tumbuh mikroba	Ada kontaminasi proses/media
Tidak ada koloni sama sekali	Pengenceran terlalu encer atau mikroba tidak viabel
Label hilang/salah	Data tidak bisa dipercaya

Jika koloni terlalu padat, gunakan cawan dari pengenceran yang lebih tinggi, misalnya dari 10⁻⁵ atau 10⁻⁶.

Jika koloni terlalu sedikit, gunakan cawan dari pengenceran yang lebih rendah, misalnya 10⁻³ atau 10⁻⁴.

12. Pengamatan khusus pada media PGPM

✓ A. Media NA / TSA

Pada media ini, amati variasi koloni bakteri umum.

Koloni yang menarik untuk dipilih:

Tumbuh terpisah
Tidak berbau busuk
Bentuk jelas
Warna berbeda
Tidak terlalu berlendir ekstrem
Tumbuh stabil

Contoh calon isolat:

Koloni krem bulat
Koloni putih kering
Koloni kuning halus
Koloni tidak beraturan tapi stabil

✓ B. Media Pikovskaya / NBRIP

Media ini digunakan untuk mencari bakteri pelarut fosfat.

Koloni yang menarik adalah koloni dengan:

Zona bening di sekitar koloni

Catat:

Diameter koloni
Diameter zona bening
Kejelasan zona bening
Kecepatan munculnya zona bening

Contoh catatan:

Koloni PSB-01:
Diameter koloni 3 mm
Diameter zona bening 8 mm
Zona jelas pada hari ke-3

Isolat dengan zona bening besar dan cepat muncul lebih menarik untuk diuji lanjut.

✓ C. Media Aleksandrov

Jika menggunakan media pelarut kalium, amati zona bening.

Koloni menarik:

Tumbuh baik
Ada zona bening
Zona tidak terlalu samar
Koloni mudah dipisahkan

✓ D. Media bebas nitrogen

Jika menggunakan media bebas nitrogen untuk calon penambat nitrogen, koloni yang tumbuh menunjukkan kemampuan awal untuk bertahan pada media tanpa nitrogen tambahan.

Namun, ini baru indikasi awal. Perlu uji lanjutan sebelum dinyatakan sebagai penambat nitrogen.

13. Pengamatan khusus pada media APH

✓ A. Calon Trichoderma pada PDA / TSM

Ciri yang dicari:

Pertumbuhan cepat
Awal putih
Kemudian hijau
Tepi pertumbuhan aktif
Tidak berbau busuk
Tidak berwarna hitam pekat menyebar cepat

Koloni Trichoderma biasanya mulai terlihat sebagai miselium putih, lalu bagian tengah atau permukaan berubah hijau karena pembentukan spora.

✓ B. Calon Bacillus pada NA / TSA

Ciri yang sering dijumpai:

Koloni putih/krem
Permukaan agak kering
Tepi bisa rata atau bergelombang
Tumbuh cepat
Beberapa tampak kasar atau berkerut

Bacillus menarik sebagai APH karena banyak isolatnya tahan formulasi, mampu membentuk spora, dan mudah dikembangkan.

✓ C. Calon Pseudomonas pada King’s B

Ciri awal:

Koloni halus
Tumbuh dalam 24–48 jam
Beberapa isolat menghasilkan pigmen fluoresen
Dapat diamati di bawah UV bila fasilitas tersedia

Jangan membuka cawan sembarangan saat pengecekan. Gunakan pengamatan dari luar cawan.

✓ D. Calon Streptomyces

Ciri awal:

Koloni kering
Tampak seperti tepung
Berbau tanah
Tumbuh lambat
Warna putih, krem, abu-abu, atau cokelat muda

Streptomyces biasanya perlu waktu inkubasi lebih panjang dibanding bakteri umum.

14. Keamanan saat inkubasi

Karena isolat belum diketahui identitasnya, perlakukan semua cawan sebagai bahan biologis yang perlu hati-hati.

Aturan aman:

Jangan menghirup langsung aroma dari cawan.
Jangan membuka cawan tanpa kebutuhan.
Jangan menyentuh koloni dengan tangan.
Jangan menyimpan cawan dekat makanan atau minuman.
Jangan membawa cawan ke area rumah tangga.
Gunakan sarung tangan saat memindahkan cawan.
Cawan yang tidak dipakai harus disterilkan sebelum dibuang.
Jika muncul koloni berbau busuk kuat, berlendir ekstrem, atau tampak mencurigakan, jangan dilanjutkan.

15. Kapan cawan siap masuk Tahap 6?

Cawan siap masuk Tahap 6 bila:

Koloni sudah terlihat jelas
Ada koloni yang terpisah
Ciri koloni bisa dibedakan
Cawan tidak terlalu penuh
Kontrol negatif bersih
Koloni target sudah cukup matang untuk dipindahkan

Waktu praktis:

Target	Waktu mulai seleksi
Bakteri umum	24–72 jam
Bakteri pelarut fosfat	2–5 hari
Bacillus	24–72 jam
Pseudomonas	24–72 jam
Trichoderma	3–5 hari
Jamur umum	3–7 hari
Streptomyces	5–10 hari

16. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Suhu terlalu tinggi	Mikroba target stres atau mati
Cawan tidak dibalik	Embun menetes dan koloni menyebar
Cawan sering dibuka	Kontaminasi meningkat
Inkubasi terlalu lama	Koloni saling menutup
Tidak mencatat hari pengamatan	Data seleksi tidak rapi
Cawan disimpan dekat sinar matahari	Suhu tidak stabil
Kontrol negatif diabaikan	Kontaminasi tidak terdeteksi
Semua jenis mikroba diinkubasi terlalu lama	Koloni cepat tumbuh menutupi koloni lambat

17. Output tahap 5

Output tahap ini adalah:

Cawan dengan koloni mikroba yang sudah tumbuh dan siap diseleksi

Contoh output:

Kode cawan	Hasil
RZ-CB-01 / NA / 10⁻⁵	Koloni bakteri terpisah, variasi krem-putih-kuning
RZ-CB-01 / Pikovskaya / 10⁻⁴	Beberapa koloni membentuk zona bening
KP-01 / PDA / 10⁻³	Jamur putih-hijau tumbuh cepat, calon Trichoderma
RZ-CB-01 / kontrol / NA	Tidak ada pertumbuhan, kontrol bersih

✓ Ringkasan Tahap 5

Cawan yang sudah ditanam → diinkubasi pada suhu sesuai target → diamati tanpa sering dibuka → dicatat warna, bentuk, tepi, ukuran, tekstur, dan jumlah koloni → pilih cawan dengan koloni terpisah untuk tahap pemurnian.

Tahap 6: Seleksi Koloni dan Pemurnian

Tujuan tahap ini

Tahap 6 bertujuan memilih koloni mikroba yang potensial, lalu memindahkannya ke media baru sampai diperoleh isolat murni.

Isolat murni adalah kultur mikroba yang berasal dari satu koloni terpisah dan memiliki ciri pertumbuhan yang seragam.

Pada tahap sebelumnya, cawan hasil inkubasi masih berisi campuran berbagai mikroba. Di tahap ini kita mulai memilih koloni terbaik untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai:

PGPM: mikroba pemacu pertumbuhan tanaman
APH: agen pengendali hayati

1. Prinsip dasar seleksi dan pemurnian

Alurnya:

Cawan hasil inkubasi
↓
Pilih koloni yang berbeda dan terpisah
↓
Ambil satu koloni dengan ose steril
↓
Goreskan ke media baru
↓
Inkubasi
↓
Pilih koloni tunggal yang seragam
↓
Ulangi 2–3 kali
↓
Diperoleh isolat murni

Tujuan utamanya bukan langsung memperbanyak mikroba, tetapi memisahkan satu jenis mikroba dari campuran mikroba lain.

✓ Diagram Tahap 6 — Seleksi Koloni dan Pemurnian

Rendering diagram...

2. Definisi istilah penting

Istilah	Arti
Koloni	Kumpulan mikroba yang tumbuh pada satu titik di media agar
Isolat	Mikroba yang sudah dipisahkan dari campuran
Isolat murni	Isolat yang ciri koloninya seragam dan tidak tercampur mikroba lain
Ose	Jarum/kawat kecil untuk mengambil dan menggores mikroba
Streak plate	Teknik menggores mikroba pada media agar untuk mendapatkan koloni tunggal
Koloni tunggal	Koloni yang tumbuh terpisah dari koloni lain
Morfologi koloni	Ciri fisik koloni, seperti warna, bentuk, tepi, tekstur, dan ukuran

3. Alat dan bahan

Siapkan:

Alat/Bahan	Fungsi
Cawan hasil inkubasi	Sumber koloni yang akan dipilih
Cawan media baru	Tempat pemurnian isolat
Ose steril / jarum inokulasi steril	Mengambil dan menggores koloni
Spidol permanen	Memberi kode isolat
Alkohol 70%	Membersihkan area kerja
Bunsen / spiritus / area kerja bersih	Membantu menjaga kondisi steril
Sarung tangan	Melindungi pekerja dan sampel
Parafilm/plastik wrap laboratorium	Menutup cawan bila diperlukan
Buku catatan isolat	Mencatat ciri dan asal koloni

4. Memilih cawan yang layak untuk seleksi

Jangan semua cawan langsung dipakai. Pilih cawan yang paling rapi.

Cawan yang layak:

Koloni tumbuh terpisah
Tidak terlalu padat
Tidak tertutup jamur menyebar
Tidak ada kontaminasi ekstrem
Label lengkap
Media tidak terlalu basah
Kontrol negatif bersih

Cawan yang kurang layak:

Koloni terlalu padat dan menyatu
Seluruh permukaan tertutup mikroba
Banyak cairan mengalir
Ada bau busuk kuat
Ada koloni berlendir ekstrem
Kontrol negatif ikut tumbuh mikroba
Label tidak jelas

Jika cawan terlalu padat, pilih cawan dari pengenceran lebih tinggi, misalnya 10⁻⁵ atau 10⁻⁶.

5. Kriteria koloni yang dipilih

Koloni dipilih berdasarkan perbedaan morfologi dan indikasi fungsi.

✓ A. Ciri morfologi koloni

Amati:

Ciri	Contoh
Warna	putih, krem, kuning, hijau, abu-abu
Bentuk	bulat, tidak beraturan, menyebar
Tepi	rata, bergelombang, bergerigi
Permukaan	halus, kasar, berkerut, bertepung
Elevasi	datar, cembung, timbul
Ukuran	kecil, sedang, besar
Kecepatan tumbuh	cepat, sedang, lambat
Tekstur	kering, licin, kapas, tepung

Pilih beberapa koloni yang berbeda agar keragaman isolat tetap terjaga.

6. Kriteria koloni untuk PGPM

Untuk calon PGPM, pilih koloni dengan ciri berikut.

✓ A. Dari media NA / TSA

Media ini untuk bakteri umum.

Pilih koloni yang:

Tumbuh terpisah
Tidak berbau busuk
Bentuk jelas
Warna berbeda-beda
Mudah dipindahkan
Tidak menyebar terlalu liar

Contoh pilihan:

PGPM-01: koloni krem, bulat, tepi rata
PGPM-02: koloni putih, agak kering, tepi bergelombang
PGPM-03: koloni kuning muda, halus, cembung

✓ B. Dari media Pikovskaya / NBRIP

Media ini untuk mencari bakteri pelarut fosfat.

Pilih koloni yang memiliki:

Zona bening di sekitar koloni

Prioritas seleksi:

Zona bening jelas
Zona bening besar
Koloni tumbuh stabil
Koloni terpisah dari koloni lain
Zona muncul cepat

Contoh kode:

PSB-01: koloni putih, zona bening jelas
PSB-02: koloni krem, zona bening sedang
PSB-03: koloni kecil, zona bening besar

PSB adalah Phosphate Solubilizing Bacteria, yaitu bakteri pelarut fosfat.

✓ C. Dari media pelarut kalium

Jika menggunakan media pelarut kalium, misalnya Aleksandrov Agar, pilih koloni dengan zona bening.

Contoh kode:

KSB-01
KSB-02
KSB-03

KSB adalah Potassium Solubilizing Bacteria, yaitu bakteri pelarut kalium.

7. Kriteria koloni untuk APH

Untuk calon APH, pilih koloni yang berpotensi menekan patogen tanaman.

✓ A. Calon Trichoderma

Dari media PDA atau TSM, pilih koloni jamur dengan ciri:

Tumbuh cepat
Awalnya putih
Kemudian berubah hijau
Tepi pertumbuhan aktif
Tekstur seperti kapas lalu bertepung
Tidak berbau busuk

Contoh kode:

TRI-01
TRI-02
TRI-03

Catatan: Trichoderma sebaiknya dimurnikan dari bagian tepi koloni yang masih aktif tumbuh, bukan dari bagian tengah yang terlalu tua.

✓ B. Calon Bacillus

Dari media NA atau TSA, pilih koloni bakteri dengan ciri:

Putih, krem, atau kekuningan
Agak kering
Bisa berkerut
Tepi bisa bergelombang
Tumbuh cukup cepat

Contoh kode:

BAC-01
BAC-02
BAC-03

Bacillus menarik sebagai APH karena banyak jenisnya mampu membentuk spora dan relatif tahan dalam formulasi.

✓ C. Calon Pseudomonas

Dari media King’s B, pilih koloni dengan ciri:

Halus
Licin
Tumbuh cepat
Beberapa menunjukkan warna fluoresen kehijauan di bawah lampu UV

Contoh kode:

PSE-01
PSE-02
PSE-03

✓ D. Calon Streptomyces

Dari media Starch Casein Agar, pilih koloni dengan ciri:

Kering
Bertepung
Tumbuh lambat
Warna putih, krem, abu-abu, atau cokelat muda
Bau seperti tanah, bukan bau busuk

Contoh kode:

STR-01
STR-02
STR-03

8. Koloni yang sebaiknya tidak dilanjutkan

Jangan lanjutkan koloni yang:

Berbau busuk menyengat
Berlendir ekstrem
Menyebar sangat invasif sampai menutup semua media
Berasal dari cawan kontrol negatif yang terkontaminasi
Tumbuh dari sumber sampel berisiko
Menunjukkan warna dan bau mencurigakan
Sulit dikendalikan saat dipindahkan
Menyebabkan media cepat rusak atau cair

Untuk pekerjaan pertanian, lebih baik memilih isolat yang stabil, aman, dan mudah dikultur, bukan hanya yang tumbuh paling cepat.

9. Pemberian kode isolat

Setiap koloni yang dipilih harus langsung diberi kode.

Format kode sederhana:

Jenis target - sumber - nomor isolat

Contoh:

Kode	Arti
PGPM-RZ-01	Calon PGPM dari rizosfer nomor 1
PSB-RZ-01	Bakteri pelarut fosfat dari rizosfer nomor 1
KSB-RZ-01	Bakteri pelarut kalium dari rizosfer nomor 1
TRI-KP-01	Calon Trichoderma dari kompos nomor 1
BAC-RZ-01	Calon Bacillus dari rizosfer nomor 1
PSE-RZ-01	Calon Pseudomonas dari rizosfer nomor 1
STR-RZ-01	Calon Streptomyces dari rizosfer nomor 1
APH-RZ-01	Calon agen pengendali hayati dari rizosfer nomor 1

Kode harus dicatat sejak awal agar isolat tidak tertukar.

10. Cara pemurnian bakteri dengan metode gores

Metode ini digunakan untuk bakteri seperti PGPM umum, PSB, KSB, Bacillus, Pseudomonas, dan Streptomyces muda.

✓ Langkah kerja

✓ Langkah 1 — Siapkan media baru

Gunakan media sesuai asal isolat.

Contoh:

Asal koloni	Media pemurnian
Koloni dari NA	NA baru
Koloni dari TSA	TSA baru
Koloni dari Pikovskaya	Pikovskaya atau NA
Koloni dari NBRIP	NBRIP atau NA
Koloni dari King’s B	King’s B atau NA
Koloni dari Starch Casein Agar	Starch Casein Agar

Untuk pemurnian awal, sebaiknya gunakan media yang sama dengan media asal agar isolat tidak stres.

✓ Langkah 2 — Labeli cawan baru

Contoh label:

PSB-RZ-01 / Purifikasi 1 / Pikovskaya / Tanggal

Atau lebih singkat:

PSB-RZ-01 / P1 / 12-05-2026

Keterangan:

P1 = pemurnian pertama
P2 = pemurnian kedua
P3 = pemurnian ketiga

✓ Langkah 3 — Ambil satu koloni terpisah

Buka cawan sebentar saja.

Ambil satu koloni target menggunakan ose steril.

Ambil dari koloni yang:

Terpisah
Tidak menyentuh koloni lain
Ciri morfologinya jelas
Tidak tercampur koloni lain

Jangan mengambil bagian koloni yang menempel dengan koloni lain.

✓ Langkah 4 — Goreskan ke media baru

Goreskan ose pada media baru dengan pola kuadran atau zigzag.

Contoh pola sederhana:

Area 1: gores rapat
Area 2: tarik dari area 1, gores lebih renggang
Area 3: tarik dari area 2, gores lebih renggang
Area 4: tarik dari area 3, gores paling renggang

Tujuan pola ini adalah membuat jumlah mikroba semakin berkurang pada setiap area, sehingga muncul koloni tunggal.

✓ Langkah 5 — Inkubasi

Inkubasi sesuai jenis mikroba:

Mikroba	Suhu	Waktu
Bakteri umum	28–30°C	24–72 jam
PSB / KSB	28–30°C	2–5 hari
Bacillus	28–30°C	24–72 jam
Pseudomonas	28–30°C	24–72 jam
Streptomyces	28–30°C	5–10 hari

✓ Langkah 6 — Periksa keseragaman

Setelah tumbuh, amati:

Apakah bentuk koloni seragam?
Apakah warna koloni sama?
Apakah teksturnya sama?
Apakah masih ada koloni berbeda?
Apakah ada kontaminasi jamur atau bakteri lain?

Jika masih ada koloni berbeda, lakukan pemurnian ulang.

11. Cara pemurnian jamur / Trichoderma

Untuk jamur, terutama Trichoderma, tekniknya sedikit berbeda.

✓ Langkah kerja

✓ Langkah 1 — Pilih bagian tepi koloni

Ambil dari bagian tepi koloni yang masih aktif tumbuh.

Bagian tepi biasanya lebih muda dan lebih bersih daripada bagian tengah.

✓ Langkah 2 — Ambil potongan kecil miselium

Gunakan jarum steril atau ose steril.

Ambil potongan kecil dari ujung hifa atau bagian tepi miselium.

Miselium adalah benang-benang halus penyusun tubuh jamur.

✓ Langkah 3 — Pindahkan ke PDA atau TSM baru

Letakkan potongan kecil tersebut di bagian tengah media baru.

Gunakan media:

PDA untuk jamur umum
TSM untuk Trichoderma bila tersedia

✓ Langkah 4 — Inkubasi

Inkubasi pada:

25–28°C selama 3–5 hari

Untuk jamur tertentu bisa sampai 7 hari.

✓ Langkah 5 — Ulangi sampai seragam

Jika masih ada jamur lain atau bakteri ikut tumbuh, ulangi pemindahan dari tepi koloni yang paling bersih.

Biasanya perlu:

2–3 kali pemurnian

12. Tanda isolat sudah murni

Isolat dianggap murni sementara bila:

Koloni terlihat seragam
Warna koloni sama
Bentuk koloni sama
Tepi koloni sama
Tekstur koloni sama
Tidak ada koloni lain yang berbeda
Saat digores ulang, hasilnya tetap seragam
Tidak muncul kontaminan pada media baru

Untuk kepastian lebih kuat, isolat perlu diuji lanjut secara mikroskopis atau molekuler, tetapi untuk tahap seleksi awal, keseragaman koloni sudah cukup sebagai dasar kerja berikutnya.

13. Berapa kali pemurnian perlu dilakukan?

Rekomendasi praktis:

Pemurnian 1: mengambil koloni target dari cawan campuran
Pemurnian 2: mengambil koloni tunggal dari hasil pemurnian 1
Pemurnian 3: konfirmasi keseragaman isolat

Jadi minimal lakukan 2 kali, idealnya 3 kali.

Kode pencatatan:

Tahap	Kode
Pemurnian pertama	P1
Pemurnian kedua	P2
Pemurnian ketiga	P3

Contoh:

PSB-RZ-01-P1
PSB-RZ-01-P2
PSB-RZ-01-P3

14. Pencatatan morfologi isolat

Setiap isolat harus dicatat.

Format catatan:

Parameter	Contoh catatan
Kode isolat	PSB-RZ-01
Asal sampel	Rizosfer cabai
Media asal	Pikovskaya
Pengenceran asal	10⁻⁴
Warna koloni	Krem
Bentuk	Bulat
Tepi	Rata
Permukaan	Halus
Elevasi	Cembung
Zona bening	Ada
Tanggal isolasi	12-05-2026
Status	Pemurnian ke-2

15. Contoh tabel seleksi koloni

Kode isolat	Target	Media asal	Ciri utama	Alasan dipilih
PGPM-RZ-01	PGPM umum	NA	Krem, bulat, halus	Koloni terpisah dan stabil
PSB-RZ-01	Pelarut fosfat	Pikovskaya	Krem, zona bening	Indikasi pelarut fosfat
BAC-RZ-01	APH bakteri	NA	Putih, kering, berkerut	Calon Bacillus
TRI-KP-01	APH jamur	PDA	Putih-hijau, cepat tumbuh	Calon Trichoderma
PSE-RZ-01	APH/PGPM	King’s B	Halus, fluoresen	Calon Pseudomonas
STR-RZ-01	APH	SCA	Kering, bertepung	Calon Streptomyces

16. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Mengambil koloni yang menempel dengan koloni lain	Isolat tidak murni
Tidak mengganti atau mensterilkan ose	Kontaminasi silang
Tidak memberi kode sejak awal	Isolat tertukar
Mengambil jamur dari bagian yang terlalu tua	Kontaminasi lebih tinggi
Tidak mengulang pemurnian	Isolat masih campuran
Membuka cawan terlalu lama	Kontaminasi udara
Memilih koloni hanya karena tumbuh cepat	Bisa kehilangan isolat penting yang tumbuh lambat
Tidak mencatat media asal	Sulit menelusuri fungsi isolat
Mengabaikan koloni dengan zona bening	Calon PGPM potensial terlewat

17. Keamanan kerja

Karena identitas isolat belum pasti, lakukan prinsip aman berikut:

Jangan mencium koloni secara langsung.
Jangan menyentuh koloni dengan tangan.
Jangan membuka cawan terlalu lama.
Gunakan sarung tangan.
Kerjakan di area bersih.
Jangan membawa kultur ke area makan/minum.
Jangan melanjutkan isolat yang berbau busuk kuat.
Sterilkan limbah sebelum dibuang.
Simpan cawan dalam wadah tertutup.
Beri label “kultur mikroba” agar tidak disalahgunakan.

18. Output tahap 6

Hasil akhir Tahap 6 adalah isolat murni sementara yang siap diuji fungsinya.

Output yang diharapkan:

Output	Keterangan
Isolat PGPM murni sementara	Calon mikroba pemacu pertumbuhan
Isolat PSB	Calon bakteri pelarut fosfat
Isolat KSB	Calon bakteri pelarut kalium
Isolat Bacillus	Calon APH dan PGPM
Isolat Pseudomonas	Calon APH dan PGPM
Isolat Trichoderma	Calon APH jamur
Isolat Streptomyces	Calon APH bakteri berfilamen
Catatan morfologi isolat	Data dasar tiap isolat

✓ Ringkasan Tahap 6

Pilih cawan dengan koloni terpisah → amati morfologi koloni → pilih koloni potensial → beri kode → ambil satu koloni dengan ose steril → gores ke media baru → inkubasi → ulangi 2–3 kali sampai koloni seragam.

Tahap 7: Uji Fungsi PGPM dan APH

Tujuan tahap ini

Tahap 7 bertujuan menguji apakah isolat yang sudah dimurnikan benar-benar memiliki fungsi bermanfaat.

Pada Tahap 6, kita baru mendapatkan isolat yang tampak murni. Namun, isolat murni belum tentu berguna. Karena itu, perlu dilakukan uji fungsi.

Fokus uji dibagi menjadi dua kelompok:

Uji fungsi PGPM Untuk mengetahui kemampuan isolat dalam mendukung pertumbuhan tanaman.
Uji fungsi APH Untuk mengetahui kemampuan isolat dalam menekan patogen penyebab penyakit tanaman.

1. Definisi istilah penting

Istilah	Arti
PGPM	Plant Growth Promoting Microorganisms, mikroba pemacu pertumbuhan tanaman
APH	Agen Pengendali Hayati, mikroba yang membantu menekan patogen tanaman
Patogen tanaman	Mikroba penyebab penyakit pada tanaman
Antagonis	Mikroba yang mampu menghambat mikroba lain
Zona bening	Area jernih di sekitar koloni, tanda aktivitas pelarutan atau hambatan
Zona hambat	Area terhambatnya pertumbuhan patogen
IAA	Indole-3-Acetic Acid, hormon auksin alami yang dapat merangsang pertumbuhan akar
Siderofor	Senyawa pengikat besi yang membantu mikroba bersaing dan dapat menekan patogen
Vigor benih	Kekuatan tumbuh benih, dilihat dari panjang akar, tunas, dan persentase kecambah

2. Prinsip seleksi fungsi

Jangan langsung memakai isolat ke tanaman luas.

Urutannya harus:

Isolat murni
↓
Uji fungsi di laboratorium
↓
Uji keamanan sederhana pada benih
↓
Uji pot kecil
↓
Seleksi isolat terbaik
↓
Baru dipertimbangkan untuk formulasi

Isolat yang baik harus memenuhi tiga syarat utama:

Aman
Stabil
Memberi efek positif

✓ Diagram Tahap 7 — Uji Fungsi PGPM dan APH

Rendering diagram...

3. Uji fungsi utama untuk PGPM

PGPM diuji berdasarkan kemampuan meningkatkan pertumbuhan tanaman.

Uji awal yang disarankan:

Fungsi PGPM	Uji yang dilakukan	Indikator positif
Pelarut fosfat	Media Pikovskaya / NBRIP	Zona bening
Pelarut kalium	Media Aleksandrov	Zona bening
Penghasil IAA	Media cair + L-triptofan + reagen Salkowski	Warna merah muda
Penghasil siderofor	Media CAS	Zona oranye/kuning
Penambat nitrogen awal	Media tanpa nitrogen	Isolat mampu tumbuh
Pemacu vigor benih	Uji perkecambahan	Akar/tunas lebih baik dari kontrol

4. Uji pelarut fosfat

Tujuan

Mengetahui apakah isolat mampu melarutkan fosfat tidak larut menjadi bentuk yang lebih tersedia bagi tanaman.

Media

Gunakan salah satu:

Pikovskaya Agar
NBRIP Agar

Langkah kerja

Siapkan isolat murni.
Gores atau totol isolat pada media Pikovskaya atau NBRIP.
Inkubasi pada suhu 28–30°C.
Amati selama 2–5 hari.
Lihat apakah muncul zona bening di sekitar koloni.

Indikator positif

Isolat positif bila muncul:

Zona bening di sekitar koloni

Semakin besar dan semakin jelas zona bening, semakin menarik isolat tersebut untuk diuji lanjut.

Data yang dicatat

Parameter	Keterangan
Kode isolat	Misalnya PSB-RZ-01
Diameter koloni	Ukuran koloni
Diameter zona bening	Ukuran zona bening + koloni
Hari muncul zona	Hari ke-2, ke-3, dst.
Kejelasan zona	samar, sedang, jelas

Skor praktis

Hasil	Skor
Tidak ada zona bening	0
Zona bening samar	1
Zona bening sedang	2
Zona bening jelas dan besar	3

5. Uji pelarut kalium

Tujuan

Mengetahui apakah isolat mampu membantu melarutkan kalium dari mineral tidak larut.

Media

Gunakan:

Aleksandrov Agar

Langkah kerja

Totol isolat murni pada media Aleksandrov.
Inkubasi pada suhu 28–30°C.
Amati selama 3–7 hari.
Lihat apakah terbentuk zona bening.

Indikator positif

Koloni tumbuh + ada zona bening di sekitar koloni

Catatan seleksi

Pilih isolat yang:

Zona bening jelas
Tumbuh stabil
Tidak berubah morfologi saat dimurnikan ulang
Tidak menghambat perkecambahan benih

6. Uji penghasil IAA

Tujuan

Mengetahui apakah isolat mampu menghasilkan senyawa mirip hormon auksin yang dapat membantu pertumbuhan akar.

IAA adalah Indole-3-Acetic Acid, salah satu bentuk auksin.

Prinsip uji

Isolat ditumbuhkan pada media cair yang diberi L-triptofan. Jika isolat menghasilkan IAA, setelah ditambah reagen Salkowski akan muncul warna merah muda sampai kemerahan.

Bahan umum

Bahan	Fungsi
Media cair Nutrient Broth atau Tryptic Soy Broth	Menumbuhkan bakteri
L-triptofan	Prekursor pembentukan IAA
Reagen Salkowski	Indikator perubahan warna
Tabung reaksi	Wadah uji
Isolat murni	Mikroba yang diuji

Langkah kerja sederhana

Masukkan isolat ke media cair yang mengandung L-triptofan.
Inkubasi pada suhu 28–30°C selama 24–72 jam.
Ambil cairan kultur bagian atas atau filtratnya.
Tambahkan reagen Salkowski.
Diamkan beberapa menit di tempat tidak terkena cahaya langsung.
Amati perubahan warna.

Indikator positif

Warna	Interpretasi
Tidak berubah	Negatif atau sangat rendah
Merah muda pucat	Positif lemah
Merah muda jelas	Positif sedang
Merah kemerahan	Positif kuat

Catatan penting

Isolat penghasil IAA tinggi belum tentu selalu terbaik. IAA yang terlalu tinggi dapat mengganggu pertumbuhan akar. Karena itu, hasil uji IAA harus dikonfirmasi dengan uji benih atau uji pot kecil.

7. Uji siderofor

Tujuan

Mengetahui apakah isolat mampu menghasilkan siderofor, yaitu senyawa yang mengikat besi.

Siderofor penting karena:

Membantu mikroba memperoleh unsur besi
Membantu mikroba bersaing di sekitar akar
Dapat menekan patogen karena patogen kekurangan besi
Mendukung fungsi PGPM dan APH
Media

Gunakan:

CAS Agar

CAS adalah Chrome Azurol S Agar, media indikator untuk siderofor.

Langkah kerja

Totol isolat pada CAS Agar.
Inkubasi pada suhu 28–30°C.
Amati selama 2–5 hari.
Perhatikan perubahan warna di sekitar koloni.

Indikator positif

Isolat positif bila muncul:

Zona oranye / kuning di sekitar koloni

Skor praktis

Hasil	Skor
Tidak ada perubahan warna	0
Zona oranye kecil	1
Zona oranye sedang	2
Zona oranye jelas dan luas	3

8. Uji kemampuan tumbuh pada media tanpa nitrogen

Tujuan

Menyeleksi awal isolat yang berpotensi berperan dalam siklus nitrogen.

Media

Gunakan media tanpa nitrogen, misalnya:

Ashby
N-free malate
JNFb

Langkah kerja

Inokulasikan isolat ke media tanpa nitrogen.
Inkubasi pada suhu 28–30°C.
Amati pertumbuhan selama 2–7 hari.
Bandingkan dengan kontrol tanpa isolat.

Indikator awal positif

Isolat mampu tumbuh pada media tanpa nitrogen

Catatan penting

Kemampuan tumbuh pada media tanpa nitrogen belum cukup untuk menyatakan isolat sebagai penambat nitrogen kuat. Itu baru indikasi awal. Perlu uji lanjutan untuk memastikan fungsinya.

9. Uji vigor benih untuk PGPM

Tujuan

Mengetahui apakah isolat memberi efek positif, netral, atau negatif terhadap perkecambahan dan pertumbuhan awal tanaman.

Ini uji yang sangat penting karena isolat yang bagus di media laboratorium belum tentu bagus untuk tanaman.

Bahan

Bahan	Fungsi
Benih sehat dan seragam	Bahan uji
Isolat murni	Perlakuan
Air steril / NaCl steril	Kontrol
Tisu steril / kertas merang / kapas steril	Media perkecambahan
Wadah steril	Tempat uji
Label	Identitas perlakuan

Perlakuan minimal

Gunakan minimal dua perlakuan:

Kontrol       : benih tanpa isolat
Perlakuan 1   : benih + isolat PGPM

Lebih baik jika ada beberapa isolat:

Kontrol
PGPM-01
PGPM-02
PGPM-03
PSB-01
BAC-01
PSE-01

Langkah kerja

Pilih benih yang ukurannya seragam.
Rendam atau perlakukan benih dengan suspensi isolat.
Susun benih di atas media perkecambahan lembap.
Inkubasi pada kondisi sesuai kebutuhan benih.
Amati selama beberapa hari.
Catat persentase kecambah, panjang akar, panjang tunas, dan kondisi bibit.

Data yang dicatat

Parameter	Keterangan
Persentase kecambah	Berapa persen benih tumbuh
Panjang akar	Indikator efek pada akar
Panjang tunas	Indikator pertumbuhan awal
Jumlah akar lateral	Indikator stimulasi akar
Warna kecambah	Sehat atau pucat
Gejala busuk	Ada atau tidak
Vigor umum	Lemah, sedang, kuat

Interpretasi

Hasil	Keputusan
Kecambah lebih baik dari kontrol	Isolat layak lanjut
Sama dengan kontrol	Isolat netral, masih bisa diuji lanjut
Kecambah lebih buruk dari kontrol	Isolat tidak diprioritaskan
Muncul busuk benih/akar	Isolat dihentikan

10. Uji fungsi utama untuk APH

APH diuji berdasarkan kemampuannya menekan patogen tanaman.

Uji awal yang disarankan:

Fungsi APH	Uji yang dilakukan	Indikator positif
Antagonis jamur patogen	Dual culture	Pertumbuhan patogen terhambat
Antibiosis bakteri	Zona hambat	Ada area hambatan
Kompetisi ruang	Pertumbuhan APH cepat dan menekan patogen
Mikoparasitisme	APH tumbuh menutupi patogen	Perlu pengamatan lanjut
Proteksi awal tanaman	Uji benih/pot kecil	Tanaman lebih sehat dibanding kontrol sakit

11. Uji antagonis APH dengan metode dual culture

Tujuan

Mengetahui apakah isolat APH mampu menghambat pertumbuhan patogen tanaman pada media agar.

Uji ini umum digunakan untuk calon APH seperti:

Trichoderma
Bacillus
Pseudomonas
Streptomyces
Yeast antagonis
Catatan keamanan

Gunakan hanya patogen tanaman yang jelas asal-usulnya dan ditangani di laboratorium yang sesuai. Jangan menggunakan mikroba dari manusia, hewan, feses, limbah medis, atau sumber berisiko.

✓ A. Dual culture untuk Trichoderma melawan jamur patogen

Media

Biasanya menggunakan:

PDA

Prinsip

APH dan patogen ditumbuhkan pada satu cawan yang sama, tetapi ditempatkan berhadapan. Lalu diamati apakah APH mampu menghambat pertumbuhan patogen.

Langkah kerja umum

Siapkan cawan PDA baru.
Letakkan potongan kecil patogen tanaman di satu sisi cawan.
Letakkan potongan kecil calon APH di sisi berlawanan.
Jarak antar keduanya dibuat cukup agar pertumbuhan dapat diamati.
Inkubasi pada suhu 25–28°C.
Amati pertumbuhan setiap hari.
Bandingkan dengan kontrol patogen tanpa APH.

Indikator positif

Isolat APH dianggap potensial bila:

Pertumbuhan patogen lebih lambat dibanding kontrol
Ada zona hambat antara APH dan patogen
APH tumbuh mendekati atau menutupi patogen
Patogen berubah warna, menipis, atau berhenti tumbuh
Diameter patogen lebih kecil dibanding kontrol

12. Rumus persentase hambatan patogen

Gunakan rumus:

% hambatan = [(R1 - R2) / R1] × 100

Keterangan:

Simbol	Arti
R1	Jari-jari pertumbuhan patogen pada kontrol tanpa APH
R2	Jari-jari pertumbuhan patogen pada perlakuan dengan APH

Interpretasi praktis

Persentase hambatan	Kategori
< 30%	Lemah
30–60%	Sedang
>60%	Kuat

Isolat dengan hambatan di atas 60% layak diprioritaskan untuk uji lanjutan.

13. Uji zona hambat untuk bakteri APH

Tujuan

Mengetahui apakah bakteri calon APH menghasilkan senyawa yang dapat menghambat patogen tanaman.

Cocok untuk:

Bacillus
Pseudomonas
Streptomyces
Yeast antagonis tertentu
Prinsip

Patogen ditumbuhkan di media, lalu calon APH ditempatkan di dekatnya. Jika APH menghasilkan senyawa penghambat, akan muncul area hambatan.

Indikator positif

Ada area kosong / zona hambat di sekitar koloni APH

Data yang dicatat

Parameter	Keterangan
Kode APH	Misalnya BAC-RZ-01
Patogen target	Misalnya Fusarium tanaman
Diameter zona hambat	Dalam mm
Hari pengamatan	Hari ke-1, ke-2, dst.
Kategori	Lemah, sedang, kuat

14. Uji proteksi awal pada benih atau bibit

Tujuan

Mengetahui apakah APH mampu membantu tanaman bertahan terhadap tekanan penyakit pada skala kecil.

Uji ini dilakukan setelah isolat menunjukkan hasil baik pada uji laboratorium.

Perlakuan minimal

Gunakan beberapa perlakuan:

Kontrol sehat             : tanaman tanpa patogen, tanpa APH
Kontrol sakit             : tanaman + patogen, tanpa APH
Perlakuan APH             : tanaman + APH + patogen
Perlakuan APH saja        : tanaman + APH, tanpa patogen

Parameter yang diamati

Parameter	Keterangan
Persentase tanaman hidup	Semakin tinggi semakin baik
Tingkat penyakit	Layu, busuk akar, rebah semai, bercak
Panjang akar	Indikator kesehatan akar
Bobot segar tanaman	Indikator pertumbuhan
Warna daun	Hijau, pucat, kuning
Gejala fitotoksik	Ada/tidak efek negatif dari isolat

Interpretasi

APH layak lanjut bila:

Tanaman perlakuan APH lebih sehat daripada kontrol sakit
Tingkat penyakit lebih rendah
Akar lebih baik
Tidak ada gejala toksik pada tanaman
APH saja tidak merusak tanaman

15. Uji keamanan sederhana pada benih

Sebelum isolat PGPM atau APH dipakai ke tanaman, lakukan uji keamanan awal.

Tujuan

Mengetahui apakah isolat menyebabkan gangguan pada benih atau kecambah.

Tanda isolat tidak aman untuk lanjut

Hentikan isolat bila muncul:

Benih busuk
Akar menghitam
Kecambah pendek abnormal
Bau busuk
Pertumbuhan jamur liar berlebihan
Persentase kecambah turun tajam
Bibit layu setelah perlakuan isolat

Isolat pertanian yang baik seharusnya tidak merusak benih atau akar muda.

16. Skoring seleksi isolat

Gunakan sistem skor agar seleksi lebih objektif.

✓ A. Skor PGPM

Kriteria	Skor 0	Skor 1	Skor 2	Skor 3
Pelarut fosfat	Tidak ada	Lemah	Sedang	Kuat
Pelarut kalium	Tidak ada	Lemah	Sedang	Kuat
IAA	Tidak ada	Lemah	Sedang	Kuat
Siderofor	Tidak ada	Lemah	Sedang	Kuat
Tumbuh stabil	Tidak	Kurang	Cukup	Stabil
Uji benih	Menghambat	Netral	Meningkat sedang	Meningkat kuat

Prioritas PGPM

Pilih isolat dengan:

Skor tinggi
Tidak menghambat benih
Stabil saat dikultur ulang
Efek positif pada akar

✓ B. Skor APH

Kriteria	Skor 0	Skor 1	Skor 2	Skor 3
Hambatan patogen	Tidak ada	< 30%	30–60%	>60%
Zona hambat	Tidak ada	Kecil	Sedang	Besar
Pertumbuhan APH	Tidak stabil	Lambat	Sedang	Cepat stabil
Uji benih	Merusak	Netral	Cukup aman	Aman dan mendukung
Uji proteksi awal	Tidak melindungi	Lemah	Sedang	Kuat

Prioritas APH

Pilih isolat dengan:

Hambatan patogen tinggi
Tidak merusak tanaman
Pertumbuhan stabil
Mudah diperbanyak
Efek proteksi terlihat

17. Contoh tabel hasil uji PGPM

Kode isolat	Pelarut P	IAA	Siderofor	Uji benih	Keputusan
PGPM-RZ-01	Sedang	Sedang	Positif	Akar lebih panjang	Lanjut
PSB-RZ-01	Kuat	Lemah	Negatif	Netral	Lanjut sebagai PSB
PGPM-RZ-02	Lemah	Kuat	Positif	Akar pendek	Tidak prioritas
BAC-RZ-01	Sedang	Sedang	Positif	Vigor naik	Lanjut

18. Contoh tabel hasil uji APH

Kode isolat	Target patogen	Hambatan	Uji benih	Keputusan
TRI-KP-01	Fusarium tanaman	72%	Aman	Lanjut
BAC-RZ-01	Rhizoctonia tanaman	55%	Aman	Lanjut
PSE-RZ-01	Fusarium tanaman	35%	Vigor naik	Lanjut terbatas
APH-RZ-04	Patogen tanaman	20%	Netral	Tidak prioritas

19. Kriteria isolat yang layak masuk tahap berikutnya

Isolat layak dilanjutkan bila memenuhi sebagian besar kriteria berikut:

✓ Untuk PGPM

Memiliki minimal satu fungsi utama yang jelas
Tidak menghambat perkecambahan
Meningkatkan panjang akar atau tunas
Tumbuh stabil
Tidak berbau busuk
Mudah dikultur ulang
Tidak mudah terkontaminasi

✓ Untuk APH

Menghambat patogen tanaman
Tidak merusak benih atau bibit
Tumbuh stabil
Mudah dimurnikan ulang
Memiliki efek proteksi awal
Tidak menunjukkan ciri berisiko

20. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Menganggap zona bening sebagai bukti final	Perlu uji tanaman juga
Hanya memilih isolat yang tumbuh cepat	Bisa melewatkan isolat potensial lain
Tidak memakai kontrol	Hasil sulit dipercaya
Tidak mengulang uji	Data kurang kuat
Tidak mencatat ukuran zona	Seleksi tidak objektif
Langsung aplikasi ke lahan luas	Risiko gagal atau tidak aman
Mengabaikan uji benih	Isolat bisa merusak akar muda
Mencampur banyak isolat tanpa uji kompatibilitas	Isolat bisa saling menghambat

21. Output tahap 7

Hasil akhir Tahap 7 adalah daftar isolat terpilih berdasarkan fungsi.

Output yang diharapkan:

Output	Keterangan
Kandidat PGPM terbaik	Isolat yang mendukung pertumbuhan tanaman
Kandidat PSB terbaik	Isolat pelarut fosfat dengan zona jelas
Kandidat KSB terbaik	Isolat pelarut kalium dengan zona jelas
Kandidat APH terbaik	Isolat yang menghambat patogen tanaman
Data uji benih	Bukti awal aman/tidaknya isolat
Skor seleksi	Dasar memilih isolat terbaik
Isolat prioritas	Siap masuk penyimpanan dan uji awal/pot kecil

✓ Ringkasan Tahap 7

Isolat murni → uji fungsi PGPM seperti pelarut fosfat, pelarut kalium, IAA, siderofor, dan vigor benih → uji fungsi APH seperti dual culture, zona hambat, dan uji proteksi awal → beri skor → pilih isolat yang aman, stabil, dan memberi efek positif.

Tahap 8: Kode Isolat, Penyimpanan, dan Uji Awal

Tujuan tahap ini

Tahap 8 bertujuan menata, menyimpan, dan menguji isolat terpilih secara awal agar isolat tidak tertukar, tetap hidup, stabil, dan siap digunakan untuk uji lanjutan.

Pada tahap ini, isolat yang sudah lolos seleksi awal dari Tahap 7 belum langsung dianggap sebagai produk. Isolat masih perlu:

Diberi kode jelas
↓
Disimpan dengan benar
↓
Dicatat karakteristiknya
↓
Diuji ulang stabilitas dan keamanannya
↓
Diuji pada benih atau pot kecil
↓
Dipilih isolat terbaik

1. Prinsip utama Tahap 8

Isolat yang bagus harus memenuhi empat syarat:

Syarat	Penjelasan
Tertelusur	Asal sampel, media, dan hasil uji jelas
Murni	Tidak tercampur mikroba lain
Stabil	Bentuk koloni dan fungsi tidak berubah saat dikultur ulang
Aman untuk tanaman	Tidak menurunkan kecambah, tidak menyebabkan busuk, tidak menghambat akar

Jadi, tahap ini bukan hanya menyimpan isolat, tetapi juga memastikan isolat layak masuk uji lanjutan.

✓ Diagram Tahap 8 — Kode Isolat, Penyimpanan, dan Uji Awal

Rendering diagram...

2. Pemberian kode isolat

Setiap isolat wajib memiliki kode unik.

Format kode yang disarankan:

Kelompok fungsi - Sumber sampel - Nomor isolat

Contoh:

Kode isolat	Arti
PGPM-RZ-01	Calon mikroba pemacu pertumbuhan dari rizosfer nomor 1
PSB-RZ-01	Bakteri pelarut fosfat dari rizosfer nomor 1
KSB-RZ-01	Bakteri pelarut kalium dari rizosfer nomor 1
BAC-RZ-01	Calon Bacillus dari rizosfer nomor 1
PSE-RZ-01	Calon Pseudomonas dari rizosfer nomor 1
TRI-KP-01	Calon Trichoderma dari kompos nomor 1
STR-RZ-01	Calon Streptomyces dari rizosfer nomor 1
APH-RZ-01	Calon agen pengendali hayati dari rizosfer nomor 1

Keterangan sumber:

Kode	Sumber
RZ	Rizosfer
AK	Akar
KP	Kompos
SR	Serasah
TN	Tanah

3. Contoh sistem kode lengkap

Agar lebih rapi, kode bisa dibuat lebih lengkap:

Jenis tanaman - sumber - fungsi - nomor isolat

Contoh:

CB-RZ-PSB-01

Artinya:

CB = cabai
RZ = rizosfer
PSB = bakteri pelarut fosfat
01 = isolat nomor 1

Contoh lain:

TM-RZ-BAC-02

Artinya:

TM = tomat
RZ = rizosfer
BAC = calon Bacillus
02 = isolat nomor 2

Pilih satu sistem kode dan gunakan secara konsisten.

4. Data yang harus dicatat

Setiap isolat harus punya catatan lengkap.

Minimal data yang dicatat:

Data	Contoh
Kode isolat	PSB-RZ-01
Asal sampel	Rizosfer cabai
Lokasi	Blok A kebun cabai
Tanggal isolasi	12/05/2026
Media asal	Pikovskaya
Pengenceran asal	10⁻⁴
Warna koloni	Krem
Bentuk koloni	Bulat
Tepi koloni	Rata
Tekstur	Halus
Fungsi awal	Pelarut fosfat
Hasil uji benih	Akar lebih panjang dari kontrol
Status	Layak simpan dan uji pot kecil

5. Format lembar data isolat

Gunakan format seperti ini:

Kode isolat        :
Tanggal isolasi    :
Asal sampel        :
Jenis tanaman      :
Lokasi             :
Media asal         :
Pengenceran asal   :
Ciri koloni        :
Target fungsi      :
Hasil uji PGPM     :
Hasil uji APH      :
Hasil uji benih    :
Status isolat      :
Catatan khusus     :

Contoh pengisian:

Kode isolat        : PSB-RZ-01
Tanggal isolasi    : 12/05/2026
Asal sampel        : Tanah rizosfer
Jenis tanaman      : Cabai
Lokasi             : Blok A
Media asal         : Pikovskaya
Pengenceran asal   : 10⁻⁴
Ciri koloni        : Krem, bulat, tepi rata, permukaan halus
Target fungsi      : Pelarut fosfat
Hasil uji PGPM     : Zona bening jelas
Hasil uji APH      : Belum diuji
Hasil uji benih    : Akar lebih panjang dari kontrol
Status isolat      : Disimpan sebagai kandidat PGPM
Catatan khusus     : Stabil sampai pemurnian ke-3

6. Membuat kultur simpan pada agar miring

Agar miring atau slant adalah media agar padat di dalam tabung yang dimiringkan saat membeku, sehingga permukaannya lebih luas.

Fungsinya:

Menyimpan isolat lebih rapi
Mengurangi risiko kontaminasi
Menghemat ruang
Memudahkan pengambilan kultur ulang
Cocok untuk penyimpanan jangka pendek

✓ A. Media agar miring sesuai target isolat

Jenis isolat	Media simpan yang disarankan
Bakteri umum PGPM	NA atau TSA slant
PSB / pelarut fosfat	NA slant atau Pikovskaya slant
KSB / pelarut kalium	NA slant atau Aleksandrov slant
Bacillus	NA atau TSA slant
Pseudomonas	NA, TSA, atau King’s B slant
Trichoderma	PDA atau TSM slant
Streptomyces	Starch Casein Agar slant

Untuk penyimpanan umum, gunakan media yang membuat isolat stabil. Untuk isolat yang sensitif, gunakan media yang sama dengan media asalnya.

7. Cara membuat agar miring

Langkah umum:

Siapkan media agar sesuai kebutuhan.
Masukkan media cair ke tabung steril.
Sterilkan media.
Setelah steril, letakkan tabung dalam posisi miring.
Biarkan sampai media memadat.
Setelah padat, agar miring siap diinokulasi isolat.

Agar miring yang baik:

Permukaannya miring dan cukup luas
Tidak terlalu basah
Tidak retak
Tidak terkontaminasi
Tabung tertutup rapat
Label jelas

8. Memindahkan isolat ke agar miring

✓ Langkah kerja

Ambil isolat murni dari cawan pemurnian terakhir.
Gunakan ose steril.
Goreskan isolat pada permukaan agar miring.
Jangan menusuk terlalu dalam ke media.
Tutup tabung dengan rapat.
Beri label lengkap.
Inkubasi sebentar sampai mikroba tumbuh.
Setelah tumbuh baik, simpan di lemari es.

✓ Waktu inkubasi sebelum disimpan

Jenis isolat	Suhu	Waktu sebelum disimpan
Bakteri umum	28–30°C	24–48 jam
Bacillus	28–30°C	24–48 jam
Pseudomonas	28–30°C	24–48 jam
PSB / KSB	28–30°C	2–4 hari
Trichoderma	25–28°C	3–5 hari
Streptomyces	28–30°C	5–10 hari

Jangan menyimpan tabung sebelum isolat tumbuh dengan baik, karena nanti sulit memastikan isolat masih hidup.

9. Label pada tabung agar miring

Label minimal:

Kode isolat
Media simpan
Tanggal simpan
Nama operator

Contoh:

PSB-RZ-01
NA Slant
15/05/2026
Operator: A

Untuk isolat yang sudah diuji fungsi, tambahkan status:

PSB-RZ-01
Pelarut fosfat kuat
NA Slant
15/05/2026

10. Penyimpanan jangka pendek

Untuk penyimpanan jangka pendek, simpan agar miring di suhu:

±4°C

Umumnya menggunakan lemari es laboratorium.

Tujuannya:

Memperlambat pertumbuhan mikroba
Mengurangi perubahan karakter
Menjaga isolat tetap hidup
Mengurangi kebutuhan subkultur terlalu sering

Jangan simpan kultur mikroba di lemari es yang digunakan untuk makanan.

11. Lama penyimpanan jangka pendek

Lama penyimpanan tergantung jenis isolat.

Jenis isolat	Lama simpan sementara
Bakteri umum	1–3 bulan
Bacillus	3–6 bulan, kadang lebih stabil
Pseudomonas	1–2 bulan
PSB / KSB	1–3 bulan
Trichoderma	2–6 bulan
Streptomyces	3–6 bulan

Tetap lakukan pengecekan berkala karena viabilitas isolat bisa berbeda-beda.

12. Penyimpanan jangka lebih panjang

Jika fasilitas laboratorium tersedia, isolat bisa disimpan dengan metode yang lebih stabil.

Pilihan umum:

Metode	Keterangan
Agar miring di 4°C	Mudah, cocok jangka pendek
Gliserol stok beku	Cocok untuk bakteri, lebih stabil
Penyimpanan spora jamur	Cocok untuk Trichoderma
Liofilisasi	Sangat baik, tetapi butuh fasilitas khusus

Untuk skala praktis, minimal buat dua stok:

Stok kerja
Stok cadangan

Stok kerja digunakan untuk aktivitas rutin. Stok cadangan disimpan dan jarang dibuka.

13. Konsep stok kerja dan stok master

Sebaiknya isolat dibagi menjadi dua kelompok.

✓ A. Stok master

Stok master adalah stok utama.

Ciri:

Disimpan paling aman
Jarang dibuka
Tidak dipakai untuk kerja harian
Menjadi sumber bila stok kerja rusak

✓ B. Stok kerja

Stok kerja adalah stok yang digunakan untuk uji rutin.

Ciri:

Boleh sering digunakan
Dibuat dari stok master
Diganti secara berkala
Tidak boleh menjadi satu-satunya stok

Prinsipnya:

Stok master jangan sering dibuka.
Gunakan stok kerja untuk aktivitas harian.

14. Pemeriksaan kemurnian setelah penyimpanan

Setelah isolat disimpan, lakukan pengecekan ulang.

Caranya:

Ambil sedikit kultur dari agar miring.
Goreskan ke media baru.
Inkubasi sesuai jenis mikroba.
Amati apakah koloni tetap seragam.
Bandingkan dengan catatan morfologi sebelumnya.

Isolat dianggap stabil bila:

Warna tetap sama
Bentuk koloni tetap sama
Tekstur tidak berubah drastis
Tidak muncul koloni lain
Fungsi awal masih muncul saat diuji ulang

15. Uji viabilitas isolat

Viabilitas berarti kemampuan isolat untuk tetap hidup.

Tanda isolat masih viabel:

Tumbuh kembali saat digores ke media baru
Koloni muncul dalam waktu normal
Bentuk koloni masih sesuai catatan
Tidak muncul kontaminan dominan
Tidak ada bau busuk atau perubahan aneh

Jika isolat tidak tumbuh kembali, isolat dianggap lemah atau mati dan perlu diganti dari stok cadangan.

16. Uji awal pada benih

Setelah isolat stabil, lakukan uji awal pada benih untuk memastikan efeknya terhadap tanaman.

✓ Tujuan

Menilai apakah isolat:

Aman untuk benih
Tidak menyebabkan busuk
Meningkatkan perkecambahan
Meningkatkan panjang akar
Meningkatkan vigor awal

✓ Perlakuan minimal

Gunakan:

Kontrol tanpa isolat
Isolat 1
Isolat 2
Isolat 3

Jika isolat berasal dari kelompok berbeda, bisa diuji terpisah:

PGPM-RZ-01
PSB-RZ-01
BAC-RZ-01
TRI-KP-01
PSE-RZ-01

✓ Parameter yang diamati

Parameter	Arti
Persentase kecambah	Jumlah benih yang tumbuh
Panjang akar	Efek terhadap akar
Panjang tunas	Efek terhadap pertumbuhan awal
Jumlah akar lateral	Indikator stimulasi akar
Warna kecambah	Hijau/sehat atau pucat
Gejala busuk	Ada/tidak efek negatif
Keseragaman bibit	Seragam atau tidak

Isolat yang menyebabkan benih busuk, akar pendek, atau kecambah abnormal sebaiknya tidak dilanjutkan.

17. Uji awal pada pot kecil

Setelah lolos uji benih, lanjutkan ke pot kecil.

✓ Tujuan

Mengetahui apakah isolat memberikan efek positif pada tanaman dalam media tanam yang lebih nyata.

✓ Desain sederhana

Minimal gunakan:

Perlakuan	Keterangan
Kontrol	Tanpa isolat
PGPM-01	Perlakuan isolat PGPM
PSB-01	Perlakuan isolat pelarut fosfat
APH-01	Perlakuan isolat APH
Konsorsium sederhana	Gabungan isolat yang kompatibel, bila sudah diuji

Gunakan minimal 3 ulangan per perlakuan agar hasil lebih dapat dipercaya.

18. Parameter uji pot kecil

Amati:

Parameter	Waktu pengamatan
Tinggi tanaman	Mingguan
Jumlah daun	Mingguan
Warna daun	Mingguan
Panjang akar	Akhir uji
Bobot segar tajuk	Akhir uji
Bobot segar akar	Akhir uji
Gejala penyakit	Selama uji
Gejala fitotoksik	Selama uji
Keseragaman tanaman	Selama uji

Untuk PGPM, fokus pada peningkatan pertumbuhan.

Untuk APH, fokus pada kesehatan tanaman dan penurunan gejala penyakit jika ada uji tekanan patogen tanaman.

19. Contoh desain uji pot sederhana

Misalnya menguji 4 isolat pada cabai.

Perlakuan	Ulangan	Jumlah pot
Kontrol tanpa isolat	3	3 pot
PGPM-RZ-01	3	3 pot
PSB-RZ-01	3	3 pot
BAC-RZ-01	3	3 pot
TRI-KP-01	3	3 pot

Total:

5 perlakuan × 3 ulangan = 15 pot

Catatan penting: semua pot harus menggunakan media, volume air, umur bibit, dan kondisi lingkungan yang sama.

20. Uji kompatibilitas isolat sebelum dibuat konsorsium

Jangan langsung mencampur banyak isolat.

Isolat perlu diuji apakah saling cocok.

✓ Tujuan

Mengetahui apakah satu isolat menghambat isolat lain.

Contoh kombinasi yang sering diinginkan:

Bacillus + Trichoderma
Bacillus + PSB
Pseudomonas + PSB
Trichoderma + Streptomyces
PGPM + APH

✓ Prinsip uji sederhana

Letakkan dua isolat pada media yang sama dengan jarak tertentu, lalu amati apakah terjadi hambatan.

Kombinasi dianggap kurang cocok bila:

Salah satu isolat tidak tumbuh
Ada zona hambat kuat di antara keduanya
Salah satu isolat menutup total isolat lain
Pertumbuhan berubah abnormal

Konsorsium hanya dibuat dari isolat yang saling kompatibel.

21. Evaluasi stabilitas fungsi

Isolat yang sudah disimpan perlu diuji ulang fungsinya.

Contoh:

Isolat	Fungsi awal	Uji ulang
PSB-RZ-01	Pelarut fosfat	Ulangi di Pikovskaya/NBRIP
KSB-RZ-01	Pelarut kalium	Ulangi di Aleksandrov
PGPM-RZ-01	Meningkatkan vigor	Ulangi uji benih
TRI-KP-01	Antagonis patogen	Ulangi dual culture
BAC-RZ-01	Zona hambat	Ulangi uji antagonis

Isolat layak lanjut bila fungsinya tetap muncul setelah penyimpanan dan subkultur ulang.

22. Skoring akhir isolat

Gunakan skor untuk menentukan isolat terbaik.

Kriteria	Skor 1	Skor 2	Skor 3
Kemurnian	Sering kontaminasi	Cukup stabil	Stabil
Pertumbuhan ulang	Lambat/lemah	Sedang	Cepat dan normal
Fungsi PGPM/APH	Lemah	Sedang	Kuat
Uji benih	Netral	Cukup baik	Meningkatkan vigor
Uji pot	Tidak berbeda	Sedikit lebih baik	Jelas lebih baik dari kontrol
Penyimpanan	Sulit disimpan	Cukup stabil	Stabil di stok
Keamanan tanaman	Ada gejala ringan	Aman	Aman dan mendukung pertumbuhan

Prioritaskan isolat dengan skor total tertinggi.

23. Kriteria isolat layak lanjut

✓ A. Kandidat PGPM layak lanjut bila:

Stabil saat disimpan
Tumbuh ulang dengan baik
Tidak menghambat benih
Meningkatkan akar atau tunas
Memiliki fungsi jelas, misalnya pelarut fosfat, pelarut kalium, IAA sedang, atau siderofor
Memberi hasil lebih baik dari kontrol pada uji pot kecil

✓ B. Kandidat APH layak lanjut bila:

Stabil saat disimpan
Tidak merusak benih atau bibit
Mampu menghambat patogen tanaman pada uji awal
Memberi proteksi pada uji pot kecil
Tidak menimbulkan gejala negatif pada tanaman
Bisa dikultur ulang dengan mudah

24. Kesalahan yang sering terjadi

Kesalahan	Akibat
Kode isolat tidak konsisten	Isolat tertukar
Label hanya ditulis di tutup cawan	Data hilang jika tutup tertukar
Tidak membuat stok cadangan	Isolat hilang jika stok kerja rusak
Menyimpan kultur di kulkas makanan	Tidak aman
Tidak mengecek kemurnian ulang	Kontaminasi tidak terdeteksi
Langsung membuat konsorsium	Isolat bisa saling menghambat
Tidak memakai kontrol pada uji pot	Efek isolat sulit dinilai
Tidak mencatat tanggal subkultur	Umur isolat tidak terpantau
Terlalu sering subkultur	Risiko perubahan karakter meningkat

25. Keamanan dan pembuangan limbah

Karena isolat belum tentu teridentifikasi penuh, perlakukan sebagai bahan biologis yang perlu hati-hati.

Aturan aman:

Simpan kultur di tempat khusus, bukan area makanan.
Jangan membuka tabung/cawan sembarangan.
Jangan mencium kultur secara langsung.
Jangan memakai isolat yang berbau busuk tajam.
Jangan menyebarkan isolat ke lahan luas sebelum uji bertahap.
Sterilkan limbah kultur sebelum dibuang.
Cawan lama, tips, dan tabung bekas harus dimatikan dahulu dengan autoklaf atau disinfektan yang sesuai.
Catat semua isolat yang disimpan dan yang dibuang.

26. Output akhir Tahap 8

Hasil akhir Tahap 8 adalah:

Output	Keterangan
Kode isolat final	Semua isolat punya identitas jelas
Stok agar miring	Isolat tersimpan jangka pendek
Stok cadangan	Menghindari kehilangan isolat
Lembar data isolat	Asal, ciri, fungsi, dan status tercatat
Hasil uji viabilitas	Isolat terbukti masih hidup
Hasil uji benih	Isolat aman atau tidak untuk kecambah
Hasil uji pot kecil	Isolat dibandingkan dengan kontrol
Daftar isolat prioritas	Kandidat terbaik untuk uji lanjutan/formulasi

✓ Ringkasan Tahap 8

Beri kode isolat → catat asal dan cirinya → pindahkan ke agar miring → inkubasi sampai tumbuh → simpan di 4°C → buat stok kerja dan stok cadangan → cek kemurnian dan viabilitas → uji benih → uji pot kecil → pilih isolat terbaik.

Pembuatan Media

Media merupakan komponen utama dalam proses isolasi, pemurnian, uji fungsi, dan penyimpanan mikroba. Tanpa media yang sesuai, mikroba target sulit tumbuh dengan baik, koloni sulit dibedakan, dan fungsi mikroba seperti pelarutan fosfat, pelarutan kalium, produksi siderofor, atau aktivitas antagonis terhadap patogen tanaman tidak dapat diamati secara jelas.

Dalam isolasi mikroba PGPM dan Agen Pengendali Hayati (APH), setiap media memiliki peran yang berbeda. Ada media yang digunakan sebagai larutan pengencer, media umum untuk menumbuhkan bakteri, media khusus untuk jamur, media selektif untuk kelompok mikroba tertentu, media uji fungsi, serta media penyimpanan dalam bentuk agar miring atau slant.

Karena itu, pembuatan media harus dilakukan dengan teliti. Komposisi bahan, volume air, pH, proses pemanasan, sterilisasi, hingga cara penyimpanan perlu diperhatikan agar media yang dihasilkan steril, stabil, dan mampu mendukung pertumbuhan mikroba sesuai tujuan.

Bagian ini membahas prosedur pembuatan media yang digunakan sepanjang proses isolasi mikroba lokal, mulai dari tahap suspensi awal, pengenceran, penanaman, pemurnian, uji fungsi, sampai penyimpanan isolat.

Fokus media:

NaCl steril 0,85%
NA — Nutrient Agar
TSA — Tryptic Soy Agar
PDA — Potato Dextrose Agar
Pikovskaya Agar
NBRIP Agar
Aleksandrov Agar
King’s B Agar
Starch Casein Agar
YMEA — Yeast Malt Extract Agar
Ashby Mannitol Agar
N-free Malate Semi-solid
CAS Agar
Media agar miring / slant

A. Prinsip Umum Pembuatan Media

✓ 1. Alat dasar

Siapkan:

Alat	Fungsi
Timbangan digital	Menimbang bahan
Gelas ukur	Mengukur air
Beaker glass / erlenmeyer	Melarutkan media
Hot plate / kompor pemanas	Memanaskan media
Magnetic stirrer / batang pengaduk	Mengaduk media
pH meter / kertas pH	Mengukur pH
Autoklaf / pressure cooker laboratorium	Sterilisasi
Cawan petri steril	Media plate
Tabung reaksi	Media slant
Botol media	Menyimpan media
Aluminium foil / tutup botol	Penutup saat sterilisasi

✓ 2. Aturan umum

Untuk hampir semua media:

Timbang bahan
↓
Larutkan dalam aquadest
↓
Atur pH
↓
Tambahkan agar bila media padat
↓
Panaskan sampai larut
↓
Sterilisasi
↓
Tuang ke cawan atau tabung
↓
Dinginkan
↓
Label dan simpan

✓ 3. Sterilisasi umum

Standar sterilisasi media:

121°C selama 15–20 menit

Jika menggunakan pressure cooker laboratorium:

Tekanan ±15 psi
Waktu 15–20 menit setelah tekanan tercapai

Catatan: bahan sensitif panas seperti antibiotik, beberapa vitamin, dan beberapa indikator sebaiknya disterilkan dengan filter lalu ditambahkan setelah media turun ke suhu ±45–50°C.

✓ 4. Volume media per cawan dan tabung

Bentuk media	Volume umum
Cawan petri 90 mm	15–20 ml per cawan
Tabung agar miring / slant	5–7 ml per tabung
Tabung media cair	5–10 ml per tabung
Botol stok media	Sesuai kebutuhan

B. Larutan NaCl Steril 0,85%

Dipakai pada:

Tahap 2: pembuatan suspensi awal
Tahap 3: pengenceran bertingkat
Tahap 4: kontrol negatif
Tahap 7–8: pembuatan suspensi isolat sederhana

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
NaCl	8,5 g
Aquadest	1.000 ml

✓ Komposisi 100 ml

Bahan	Jumlah
NaCl	0,85 g
Aquadest	100 ml

✓ Cara membuat

Timbang NaCl.
Larutkan dalam aquadest.
Masukkan ke botol atau tabung.
Sterilisasi pada 121°C selama 15 menit.
Dinginkan.
Simpan dalam kondisi tertutup.

Catatan: NaCl adalah natrium klorida, bukan chlorine aktif. Jangan gunakan air PAM langsung.

C. NA — Nutrient Agar

Dipakai untuk:

Isolasi bakteri umum
Bacillus
PGPM umum
Pemurnian bakteri
Media slant bakteri

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Peptone	5 g
Beef extract / ekstrak daging	3 g
NaCl	5 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0 ± 0,2

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan peptone, beef extract, dan NaCl.
Aduk sampai larut.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
Atur pH ke sekitar 7,0.
Panaskan sambil diaduk sampai agar larut.
Sterilisasi pada 121°C selama 15–20 menit.
Dinginkan sampai ±45–50°C.
Tuang ke cawan petri steril sebanyak 15–20 ml per cawan.
Biarkan memadat.

✓ Jika pakai media instan

Biasanya gunakan:

Nutrient Agar powder ±28 g/L

Tetap ikuti dosis pada label produk karena tiap merek bisa berbeda.

D. TSA — Tryptic Soy Agar

Dipakai untuk:

Bakteri umum
Bacillus
Pseudomonas
PGPM/APH bakteri
Pemurnian isolat bakteri

TSA lebih kaya nutrisi daripada NA.

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Tryptone / pancreatic digest of casein	15 g
Soy peptone / papaic digest of soybean meal	5 g
NaCl	5 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,2–7,3

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan tryptone, soy peptone, dan NaCl.
Aduk sampai larut.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 7,2–7,3.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Dinginkan sampai ±45–50°C.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Jika pakai media instan

Umumnya:

TSA powder ±40 g/L

Ikuti instruksi merek yang dipakai.

E. PDA — Potato Dextrose Agar

Dipakai untuk:

Jamur umum
Trichoderma
APH jamur
Pemurnian jamur
Dual culture APH vs patogen tanaman
PDA slant untuk penyimpanan Trichoderma

✓ Komposisi 1 liter versi laboratorium

Bahan	Jumlah
Kentang kupas	200 g
Dextrose / glucose	20 g
Agar	15 g
Aquadest	Sampai 1.000 ml
pH akhir	±5,6

✓ Cara membuat dari kentang

Kupas kentang.
Potong kecil-kecil.
Rebus 200 g kentang dalam ±500–700 ml aquadest selama 20–30 menit.
Saring air rebusan kentang.
Ambil filtratnya.
Tambahkan dextrose 20 g.
Tambahkan agar 15 g.
Tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
Atur pH sekitar 5,6.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Dinginkan sampai ±45–50°C.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Jika pakai media instan

Umumnya:

PDA powder ±39 g/L

Ikuti label produk.

✓ Catatan

Untuk menekan bakteri pada isolasi jamur, laboratorium kadang menambahkan antibiotik setelah media disterilkan dan suhunya turun ke ±45–50°C. Namun untuk penggunaan praktis, lebih aman gunakan PDA biasa atau TSM siap pakai bila tersedia.

F. Pikovskaya Agar

Dipakai untuk:

Isolasi bakteri pelarut fosfat
Uji awal PSB
Seleksi PGPM pelarut fosfat

PSB = Phosphate Solubilizing Bacteria, bakteri pelarut fosfat.

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Glucose	10 g
Tricalcium phosphate / Ca₃(PO₄)₂	5 g
Yeast extract	0,5 g
Ammonium sulfate / (NH₄)₂SO₄	0,5 g
NaCl	0,2 g
KCl	0,2 g
Magnesium sulfate / MgSO₄·7H₂O	0,1 g
Manganese sulfate / MnSO₄	0,002 g
Ferrous sulfate / FeSO₄·7H₂O	0,002 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	±7,0

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan semua bahan kecuali agar.
Aduk sampai merata.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke ±7,0.
Panaskan sambil diaduk.
Media akan tampak agak keruh karena tricalcium phosphate tidak larut sempurna. Itu normal.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Saat akan menuang, goyangkan perlahan agar endapan fosfat tersebar merata.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Indikator hasil

Koloni PSB positif biasanya membentuk:

Zona bening di sekitar koloni

G. NBRIP Agar

Dipakai untuk:

Seleksi bakteri pelarut fosfat
Alternatif Pikovskaya
Sering menghasilkan zona bening lebih jelas

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Glucose	10 g
Tricalcium phosphate / Ca₃(PO₄)₂	5 g
Magnesium chloride / MgCl₂·6H₂O	5 g
Magnesium sulfate / MgSO₄·7H₂O	0,25 g
KCl	0,2 g
Ammonium sulfate / (NH₄)₂SO₄	0,1 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	±7,0

✓ Cara membuat

Larutkan glucose, MgCl₂, MgSO₄, KCl, dan ammonium sulfate dalam ±800 ml aquadest.
Tambahkan tricalcium phosphate.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH sekitar 7,0.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Goyang perlahan sebelum menuang karena fosfat bisa mengendap.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Catatan

Endapan putih pada media adalah normal karena sumber fosfatnya tidak larut. Justru itu yang menjadi dasar uji pelarutan fosfat.

H. Aleksandrov Agar

Dipakai untuk:

Isolasi bakteri pelarut kalium
Uji KSB

KSB = Potassium Solubilizing Bacteria, bakteri pelarut kalium.

✓ Komposisi 1 liter versi umum

Bahan	Jumlah
Glucose	5 g
Magnesium sulfate / MgSO₄·7H₂O	0,5 g
Calcium carbonate / CaCO₃	0,1 g
Ferric chloride / FeCl₃	0,005 g
Calcium phosphate / Ca₃(PO₄)₂	2 g
Sumber K tidak larut: mica/feldspar/potassium aluminosilicate powder	2 g
Agar	15–20 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0–7,2

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan glucose, MgSO₄, CaCO₃, FeCl₃, dan Ca₃(PO₄)₂.
Tambahkan sumber kalium tidak larut, misalnya mica atau feldspar halus.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 7,0–7,2.
Panaskan sambil diaduk sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Goyang perlahan sebelum menuang agar mineral tidak mengendap berat di bawah.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Indikator hasil

KSB positif biasanya menunjukkan:

Zona bening di sekitar koloni

✓ Catatan penting

Jangan memakai sumber K yang mudah larut sebagai sumber utama kalium, karena tujuan media ini adalah menyeleksi mikroba yang mampu melarutkan kalium dari mineral tidak larut.

I. King’s B Agar

Dipakai untuk:

Isolasi Pseudomonas fluorescens
Seleksi bakteri rizosfer fluoresen
Kandidat PGPM dan APH

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Proteose peptone	20 g
Glycerol	10 ml
K₂HPO₄	1,5 g
MgSO₄·7H₂O	1,5 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0–7,2

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan proteose peptone, K₂HPO₄, dan MgSO₄.
Tambahkan glycerol.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 7,0–7,2.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Dinginkan sampai ±45–50°C.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Indikator hasil

Beberapa isolat Pseudomonas fluorescens menunjukkan:

Fluoresensi hijau-kuning di bawah lampu UV

J. Starch Casein Agar

Dipakai untuk:

Isolasi Streptomyces
Actinomycetes tanah
Kandidat APH

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Soluble starch	10 g
Casein	0,3 g
KNO₃	2 g
NaCl	2 g
K₂HPO₄	2 g
MgSO₄·7H₂O	0,05 g
CaCO₃	0,02 g
FeSO₄·7H₂O	0,01 g
Agar	15–18 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0–7,2

✓ Cara membuat

Masukkan ±800 ml aquadest ke erlenmeyer.
Tambahkan soluble starch dan casein.
Tambahkan KNO₃, NaCl, K₂HPO₄, MgSO₄, CaCO₃, dan FeSO₄.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 7,0–7,2.
Panaskan sambil diaduk sampai homogen.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Tuang ke cawan petri steril atau tabung slant.

✓ Ciri target

Streptomyces biasanya tumbuh sebagai koloni:

Kering
Bertepung
Warna putih, abu-abu, krem, atau cokelat
Berbau tanah

K. Starch Casein Agar Slant

Dipakai untuk:

Penyimpanan sementara Streptomyces
Stok kerja isolat actinomycetes

✓ Cara membuat slant

Buat Starch Casein Agar seperti resep di atas.
Saat media masih cair, masukkan 5–7 ml ke tiap tabung reaksi.
Tutup tabung.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Setelah keluar dari autoklaf, letakkan tabung dalam posisi miring.
Biarkan memadat.
Setelah padat, slant siap diinokulasi.

✓ Penyimpanan setelah inokulasi

Gores isolat Streptomyces pada permukaan slant.
Inkubasi 28–30°C selama 5–10 hari.
Setelah tumbuh baik, simpan di 4°C.

L. YMEA — Yeast Malt Extract Agar

Dipakai untuk:

Yeast/khamir rizosfer
Yeast antagonis
Mikroba fermentatif non-patogen dari lingkungan tanaman

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Yeast extract	3 g
Malt extract	3 g
Peptone	5 g
Glucose / dextrose	10 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	6,0–6,5

✓ Cara membuat

Larutkan yeast extract, malt extract, peptone, dan glucose dalam ±800 ml aquadest.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 6,0–6,5.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Tuang ke cawan petri steril.

M. Ashby Mannitol Agar

Dipakai untuk:

Seleksi awal mikroba yang mampu tumbuh pada media tanpa nitrogen
Terutama untuk calon Azotobacter dan mikroba terkait siklus nitrogen

✓ Komposisi 1 liter

Bahan	Jumlah
Mannitol	20 g
K₂HPO₄	0,2 g
MgSO₄·7H₂O	0,2 g
NaCl	0,2 g
K₂SO₄	0,1 g
CaCO₃	5 g
Agar	15 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0–7,2

✓ Cara membuat

Larutkan mannitol, K₂HPO₄, MgSO₄, NaCl, dan K₂SO₄ dalam ±800 ml aquadest.
Tambahkan CaCO₃.
Tambahkan agar.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Atur pH ke 7,0–7,2.
Panaskan sampai agar larut.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Goyang perlahan sebelum menuang karena CaCO₃ dapat mengendap.
Tuang ke cawan petri steril.

✓ Catatan

Pertumbuhan pada media ini hanya indikasi awal. Jangan langsung menyatakan isolat sebagai penambat nitrogen kuat tanpa uji lanjutan.

N. N-free Malate Semi-solid Medium

Dipakai untuk:

Seleksi awal Azospirillum dan mikroba terkait penambatan nitrogen
Media semi-padat, bukan agar padat penuh

✓ Komposisi 1 liter versi praktis

Bahan	Jumlah
Malic acid	5 g
K₂HPO₄	0,5 g
KH₂PO₄	0,4 g
MgSO₄·7H₂O	0,2 g
NaCl	0,1 g
CaCl₂	0,02 g
FeCl₃	0,01 g
Na₂MoO₄·2H₂O	0,002 g
Agar	1,5–2 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	6,8–7,0

✓ Cara membuat

Larutkan semua garam mineral dalam ±800 ml aquadest.
Tambahkan malic acid.
Atur pH ke 6,8–7,0.
Tambahkan agar rendah, hanya 1,5–2 g/L.
Tambahkan aquadest sampai 1 liter.
Panaskan sampai agar larut.
Masukkan ke tabung sebanyak 5–10 ml.
Sterilisasi 121°C selama 15 menit.
Dinginkan dalam posisi tegak.

✓ Indikator awal

Isolat positif awal biasanya membentuk:

Lapisan pelikel atau cincin pertumbuhan di bawah permukaan media

O. CAS Agar

Dipakai untuk:

Uji siderofor
Seleksi PGPM dan APH yang mampu mengikat besi

CAS = Chrome Azurol S Agar.

Media ini lebih rumit daripada NA, PDA, atau Pikovskaya. Untuk praktik yang lebih aman dan konsisten, sebaiknya gunakan CAS agar siap pakai atau kit dari supplier laboratorium.

✓ Prinsip hasil

Isolat penghasil siderofor akan membentuk:

Zona oranye / kuning di sekitar koloni

✓ Prosedur praktis bila memakai CAS premix

Timbang CAS agar powder sesuai dosis label produk.
Larutkan dalam aquadest.
Panaskan sampai homogen.
Sterilisasi sesuai instruksi produk.
Dinginkan sampai ±45–50°C.
Tuang ke cawan petri steril.
Biarkan memadat.
Simpan gelap di 4°C.

✓ Catatan penting

CAS sensitif terhadap kesalahan pH, komposisi besi, dan indikator warna. Jika hasil harus valid untuk riset atau produksi, gunakan media komersial atau SOP laboratorium resmi.

P. Media Cair untuk Uji IAA

Dipakai untuk:

Uji produksi IAA oleh isolat PGPM
Biasanya memakai Nutrient Broth atau Tryptic Soy Broth dengan tambahan L-triptofan

✓ Komposisi 1 liter versi sederhana

Bahan	Jumlah
Nutrient Broth atau Tryptic Soy Broth	Sesuai label / formula
L-tryptophan	0,1–0,5 g
Aquadest	1.000 ml
pH akhir	7,0 ± 0,2

✓ Cara membuat

Buat media cair NB atau TSB.
Tambahkan L-tryptophan.
Atur pH sekitar 7,0.
Masukkan ke tabung masing-masing 5–10 ml.
Sterilisasi 121°C selama 15 menit.
Dinginkan.
Media siap diinokulasi isolat.

✓ Catatan

Uji IAA memerlukan reagen Salkowski. Reagen ini bukan media pertumbuhan, melainkan reagen deteksi warna.

Q. Media Agar Miring / Slant

Dipakai pada Tahap 8 untuk penyimpanan isolat.

Media yang bisa dibuat slant:

Target isolat	Media slant
Bakteri umum	NA slant atau TSA slant
Bacillus	NA slant / TSA slant
Pseudomonas	King’s B slant / NA slant
PSB	Pikovskaya slant / NA slant
KSB	Aleksandrov slant / NA slant
Trichoderma	PDA slant / TSM slant
Streptomyces	Starch Casein Agar slant
Yeast	YMEA slant

✓ Cara umum membuat slant

Buat media sesuai resep.
Saat masih cair, masukkan 5–7 ml ke tabung reaksi.
Tutup tabung.
Sterilisasi 121°C selama 15–20 menit.
Setelah sterilisasi, letakkan tabung dalam posisi miring.
Biarkan media memadat.
Setelah padat, beri label.
Simpan sampai digunakan.

✓ Cara inokulasi slant

Ambil isolat murni dengan ose steril.
Goreskan pada permukaan slant.
Inkubasi sesuai jenis mikroba.
Setelah tumbuh, simpan di 4°C.

R. Ringkasan Media Berdasarkan Tahap

Tahap	Kebutuhan media / larutan
Tahap 1 — Pengambilan sampel	Belum memakai media, hanya wadah steril
Tahap 2 — Suspensi awal	NaCl steril 0,85%
Tahap 3 — Pengenceran bertingkat	NaCl steril 0,85%
Tahap 4 — Penanaman media	NA, TSA, PDA, Pikovskaya, NBRIP, Aleksandrov, King’s B, Starch Casein Agar
Tahap 5 — Inkubasi	Media hasil penanaman dari Tahap 4
Tahap 6 — Pemurnian	Media baru sesuai asal isolat
Tahap 7 — Uji fungsi	Pikovskaya, NBRIP, Aleksandrov, CAS, media IAA, PDA dual culture, Ashby, N-free malate
Tahap 8 — Penyimpanan	NA slant, TSA slant, PDA slant, Starch Casein Agar slant, King’s B slant, YMEA slant

S. Ringkasan Fungsi Media

Media	Fungsi utama
NaCl steril 0,85%	Suspensi dan pengenceran
NA	Bakteri umum
TSA	Bakteri umum, lebih kaya nutrisi
PDA	Jamur dan Trichoderma
Pikovskaya	Bakteri pelarut fosfat
NBRIP	Bakteri pelarut fosfat, zona bening sering jelas
Aleksandrov	Bakteri pelarut kalium
King’s B	Pseudomonas fluorescens
Starch Casein Agar	Streptomyces / actinomycetes
YMEA	Yeast/khamir
Ashby Mannitol	Seleksi awal mikroba bebas nitrogen
N-free Malate	Seleksi awal Azospirillum
CAS Agar	Uji siderofor
Slant	Penyimpanan isolat

T. Quality Control Media

Sebelum media digunakan untuk isolasi, lakukan kontrol sederhana.

✓ Kontrol sterilitas

Ambil 1 cawan dari setiap batch media.
Inkubasi tanpa inokulasi.
Amati 2–3 hari.

Media layak dipakai bila:

Tidak ada pertumbuhan mikroba

Jika muncul koloni pada media kosong, media tidak steril dan jangan digunakan.

✓ Kontrol fungsi

Media	Kontrol fungsi sederhana
NA / TSA	Bakteri umum tumbuh baik
PDA	Jamur tumbuh baik
Pikovskaya / NBRIP	Tampak keruh karena fosfat tidak larut
Aleksandrov	Ada mineral tidak larut sebagai sumber K
King’s B	Pseudomonas dapat tumbuh
Starch Casein Agar	Koloni actinomycetes tumbuh perlahan
CAS	Warna dasar stabil dan berubah bila ada siderofor

U. Penyimpanan Media Jadi

Bentuk media	Cara simpan	Lama simpan praktis
Cawan NA/TSA	4°C, terbalik, tertutup	2–4 minggu
Cawan PDA	4°C, tertutup	2–4 minggu
Cawan Pikovskaya/NBRIP	4°C, tertutup	2–4 minggu
Cawan CAS	4°C, gelap	1–2 minggu
Slant steril belum diinokulasi	4°C	1–2 bulan
NaCl steril	Suhu ruang / 4°C	1–3 bulan

Sebelum dipakai, keluarkan media dari lemari es dan biarkan mencapai suhu ruang agar tidak banyak kondensasi.

✓ Catatan akhir

Untuk pekerjaan praktis, prioritas media minimal yang perlu dibuat adalah:

NaCl steril 0,85%
NA
PDA
Pikovskaya atau NBRIP
Starch Casein Agar
King’s B
Aleksandrov
Media slant sesuai isolat

Jika fasilitas terbatas, mulai dari:

NaCl steril 0,85%
NA
PDA
Pikovskaya
Agar miring NA dan PDA

Media lainnya bisa ditambahkan setelah isolat awal diperoleh dan siap diuji fungsi.

Lampiran. Grading Kemudahan Isolasi PGPM/APH dan Sumber Mikroba Lokal dari Alam

Lampiran ini digunakan sebagai panduan awal untuk memilih target mikroba yang paling mudah diisolasi oleh pemula serta menentukan sumber sampel alami yang berpeluang tinggi mengandung mikroba bermanfaat. Dalam kelompok PGPM terdapat berbagai mikroba seperti Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Azospirillum, Trichoderma, Streptomyces, mikoriza, PSB, KSB, dan endofit, dengan fungsi yang berbeda untuk akar, hara, vigor, dan perlindungan tanaman.

Lampiran 1. Grading Kemudahan Isolasi Mikroba dari Alam

Tingkat	Target mikroba	Kemudahan	Cocok untuk pemula	Keterangan
1	Bacillus	Sangat mudah	Ya	Tahan, cepat tumbuh, banyak ditemukan di rizosfer dan kompos
2	Trichoderma	Mudah	Ya	Mudah dicari dari kompos, serasah, tanah organik
3	PSB / bakteri pelarut fosfat	Mudah–sedang	Ya	Indikator jelas berupa zona bening pada Pikovskaya/NBRIP
4	KSB / bakteri pelarut kalium	Sedang	Setelah dasar dikuasai	Butuh media Aleksandrov dan sumber mineral K tidak larut
5	Azotobacter	Sedang	Setelah dasar dikuasai	Bisa dicari dari tanah subur dan rizosfer
6	Pseudomonas fluorescens	Sedang	Pemula menengah	Lebih baik bila tersedia King’s B dan lampu UV
7	Streptomyces	Sedang–sulit	Pemula menengah	Tumbuh lambat, perlu kesabaran dan media khusus
8	Azospirillum	Sulit	Tidak untuk awal	Butuh media semi-padat dan interpretasi pelikel
9	Endofit	Sulit	Tidak disarankan untuk awal	Perlu sterilisasi permukaan jaringan tanaman yang rapi
10	Mikoriza	Sangat sulit	Tidak untuk isolasi awal	Tidak mudah dikultur di cawan agar biasa, perlu akar hidup/inang

Rekomendasi awal untuk pemula:

Bacillus → Trichoderma → PSB → KSB → Pseudomonas → Azotobacter → Streptomyces

Untuk latihan pertama, cukup mulai dari:

1. Bacillus
2. Trichoderma
3. PSB / bakteri pelarut fosfat

Lampiran 2. Sumber Mikroba Lokal dari Alam

Sumber terbaik adalah bagian tanaman atau lingkungan yang sehat, aktif secara biologis, tidak tercemar, dan tidak berbau busuk. Sampel yang diambil sebaiknya berasal dari tanah yang menempel di akar, tanah sekitar akar, kompos matang, atau serasah sehat.

Sumber alam	Bagian yang diambil	Target mikroba potensial	Tingkat rekomendasi
Akar bambu	Tanah yang menempel di akar dan serasah bambu lapuk	Bacillus, Trichoderma, Streptomyces, PSB, dekomposer	Sangat baik
Akar alang-alang	Rizosfer dan akar muda sehat	PGPR tahan stres, Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, KSB	Baik
Rizosfer cabai sehat	Tanah sekitar akar cabai sehat	PGPM spesifik cabai, Bacillus, PSB, Pseudomonas	Sangat baik
Akar tanaman legum/kacangan	Tanah sekitar akar dan bintil akar sehat	Rhizobacteria, Azotobacter, PSB	Baik
Kompos matang	Bagian tengah kompos yang sudah stabil	Trichoderma, Bacillus, Streptomyces, dekomposer	Sangat baik
Serasah hutan/kebun sehat	Daun lapuk sehat, tanah bawah serasah	Trichoderma, Streptomyces, jamur dekomposer	Baik
Akar pisang sehat	Tanah sekitar akar aktif	Bacillus, Pseudomonas, Trichoderma, PSB	Baik
Rizosfer padi/sawah sehat	Tanah sekitar akar padi	Azospirillum, Azotobacter, PSB	Sedang
Akar jagung/rumput gajah	Tanah sekitar akar serabut	Bacillus, Azospirillum, KSB, PSB	Baik
Tanah kebun organik lama	Tanah sekitar tanaman sehat	Bacillus, PSB, KSB, Streptomyces	Baik
Tanah bawah tanaman liar sehat	Rizosfer gulma sehat yang tumbuh kuat	PGPR adaptif lokal	Sedang–baik

Lampiran 3. Cara Mengambil Sumber Mikroba dari Alam

A. Akar bambu

Akar bambu sering menjadi sumber mikroba lokal yang menarik karena area perakarannya kaya bahan organik, serasah, dan aktivitas mikroba.

Bagian yang diambil:

Tanah yang menempel pada akar bambu
Tanah 1–5 cm dari akar
Serasah bambu yang sudah lapuk sehat
Tanah di bawah lapisan serasah bambu

Target mikroba potensial:

Bacillus
Trichoderma
Streptomyces
PSB
Mikroba dekomposer

Cara mengambil:

Pilih rumpun bambu yang sehat.
Hindari area yang tercemar sampah, limbah, atau bau busuk.
Buka lapisan serasah bambu bagian atas.
Ambil tanah remah di sekitar akar halus bambu.
Ambil ±10–20 gram tanah per titik.
Masukkan ke plastik steril atau wadah bersih steril.
Beri label: RZ-BMB-01.

Catatan: jangan mengambil tanah yang terlalu kering ekstrem atau bercampur kotoran hewan.

B. Akar alang-alang

Alang-alang tumbuh kuat di lahan miskin hara, kering, atau terganggu. Rizosfernya dapat menjadi sumber mikroba yang tahan stres lingkungan.

Bagian yang diambil:

Tanah sekitar akar alang-alang
Tanah yang menempel pada akar/rimpang
Akar muda sehat bila diperlukan

Target mikroba potensial:

Bacillus
Pseudomonas
Azotobacter
Azospirillum-like rhizobacteria
KSB
Mikroba tahan kering

Cara mengambil:

Pilih alang-alang yang tumbuh sehat dan kuat.
Gali perlahan sampai akar dan rimpang terlihat.
Ambil tanah yang menempel pada akar/rimpang.
Hindari akar yang busuk atau berbau.
Ambil ±10–20 gram tanah rizosfer.
Simpan dalam plastik steril.
Beri label: RZ-ALG-01.

Catatan: alang-alang cocok untuk mencari mikroba adaptif, tetapi tetap perlu uji fungsi sebelum dipakai ke tanaman budidaya.

C. Rizosfer tanaman budidaya sehat

Ini adalah sumber paling relevan bila target akhirnya untuk tanaman budidaya, misalnya cabai, tomat, melon, padi, jagung, atau hortikultura lain.

Bagian yang diambil:

Tanah yang menempel di akar tanaman sehat
Tanah sekitar 1–5 cm dari akar aktif

Target mikroba potensial:

PGPR
Bacillus
Pseudomonas
PSB
KSB
APH rizosfer

Cara mengambil:

Pilih tanaman paling sehat di lahan.
Utamakan tanaman yang tetap sehat walaupun tanaman sekitar ada yang sakit.
Gali bagian akar secara hati-hati.
Ambil tanah yang menempel di akar.
Simpan dalam wadah steril.
Beri label sesuai tanaman, misalnya: RZ-CB-01 untuk rizosfer cabai.

D. Kompos matang

Kompos matang merupakan sumber terbaik untuk pemula yang ingin mencari Trichoderma, Bacillus, dan mikroba dekomposer.

Ciri kompos yang layak:

Berbau tanah
Tidak panas
Tidak berlendir
Tidak berbau busuk
Tekstur remah
Warna cokelat gelap sampai hitam

Target mikroba potensial:

Trichoderma
Bacillus
Streptomyces
Dekomposer
Yeast lingkungan

Cara mengambil:

Pilih kompos matang.
Ambil dari bagian tengah tumpukan, bukan hanya permukaan.
Ambil ±10–20 gram.
Masukkan ke wadah steril.
Beri label: KP-01.

E. Serasah sehat

Serasah adalah daun, ranting kecil, atau bahan organik yang mulai lapuk secara alami.

Bagian yang diambil:

Daun lapuk sehat
Tanah tipis di bawah serasah
Ranting kecil yang mulai terdekomposisi

Target mikroba potensial:

Trichoderma
Streptomyces
Jamur dekomposer
Bacillus
Mikroba pengurai bahan organik

Cara mengambil:

Pilih serasah dari kebun sehat atau bawah tegakan tanaman sehat.
Hindari serasah yang berbau busuk.
Ambil ±5–10 gram serasah dan sedikit tanah bawahnya.
Masukkan ke plastik steril.
Beri label: SR-01.

Lampiran 4. Prioritas Sumber Berdasarkan Target Mikroba

Target isolasi	Sumber alam terbaik	Media awal yang disarankan
Bacillus	Rizosfer cabai, akar bambu, kompos matang, akar alang-alang	NA / TSA
Trichoderma	Kompos matang, serasah bambu, tanah bawah serasah, rizosfer sehat	PDA / TSM
PSB	Rizosfer tanaman sehat, akar bambu, tanah kebun organik	Pikovskaya / NBRIP
KSB	Akar alang-alang, rumput, jagung, tanah mineral	Aleksandrov Agar
Pseudomonas	Rizosfer tanaman sehat, tanah lembap sekitar akar	King’s B
Azotobacter	Tanah subur, rizosfer rumput, kebun organik	Ashby Mannitol
Azospirillum	Rizosfer rumput, padi, jagung, alang-alang	N-free Malate semi-solid
Streptomyces	Tanah kering remah, kompos matang, serasah lapuk	Starch Casein Agar
Yeast/khamir	Permukaan buah sehat, serasah, kompos matang	YMEA / PDA
Mikoriza	Tanah dekat akar tanaman sehat	Bukan isolasi agar biasa; perlu tanaman inang

Lampiran 5. Format Label Sampel Alam

Gunakan format label sederhana:

Kode sampel     :
Sumber          :
Lokasi          :
Tanggal         :
Jenis tanaman   :
Kondisi tanaman :
Catatan lokasi  :

Contoh:

Kode sampel     : RZ-BMB-01
Sumber          : Tanah rizosfer bambu
Lokasi          : Kebun belakang blok A
Tanggal         : 12/05/2026
Jenis tanaman   : Bambu
Kondisi tanaman : Sehat
Catatan lokasi  : Banyak serasah lapuk, tanah remah, tidak berbau

Contoh lain:

Kode sampel     : RZ-ALG-01
Sumber          : Tanah sekitar akar alang-alang
Lokasi          : Tepi lahan kering
Tanggal         : 12/05/2026
Jenis tanaman   : Alang-alang
Kondisi tanaman : Sehat dan tumbuh kuat
Catatan lokasi  : Lahan kering, tidak tercemar

Lampiran 6. Sumber yang Harus Dihindari

Jangan mengambil sampel dari:

Feses
Bangkai
Air got
Selokan
Sampah busuk
Limbah rumah tangga
Limbah peternakan segar
Limbah rumah sakit
Tanah tercemar oli
Tanah tercemar pestisida berat
Bahan yang berbau busuk menyengat

Sumber seperti ini berisiko membawa mikroba patogen, pembusuk, atau kontaminan yang tidak aman untuk dikembangkan.

Lampiran 7. Rekomendasi Praktis untuk Pemula

Untuk latihan awal, gunakan kombinasi berikut:

Paket	Sumber	Target	Media
Paket 1	Kompos matang	Trichoderma + Bacillus	PDA + NA
Paket 2	Akar bambu	Bacillus + Trichoderma + PSB	NA + PDA + Pikovskaya
Paket 3	Akar alang-alang	Bacillus + KSB + mikroba tahan stres	NA + Aleksandrov
Paket 4	Rizosfer cabai sehat	PGPM spesifik cabai	NA + Pikovskaya
Paket 5	Serasah sehat	Jamur dekomposer + Streptomyces	PDA + Starch Casein Agar

Paket paling disarankan untuk pemula:

Akar bambu + kompos matang + rizosfer tanaman sehat

Dengan tiga sumber tersebut, peluang memperoleh Bacillus, Trichoderma, PSB, dan mikroba dekomposer relatif tinggi serta lebih mudah dipelajari.

Lampiran 8. Ciri Morfologi Koloni Mikroba Target

1. Bacillus

Media umum: NA / TSA Sumber umum: kompos matang, rizosfer cabai, akar bambu, akar alang-alang

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih, krem, kekuningan muda
Bentuk	bulat sampai tidak beraturan
Tepi	rata, bergelombang, kadang bergerigi
Permukaan	kering, agak kasar, kadang berkerut
Elevasi	datar sampai cembung
Ukuran	sedang sampai besar
Kecepatan tumbuh	cepat, 24–48 jam
Tekstur	kering, matte, tidak terlalu mengilap

Ciri yang dicari: koloni kering, stabil, tidak berbau busuk, tumbuh cepat, mudah digores ulang.

Catatan: Bacillus sering lebih mudah dipilih dari koloni yang tampak kering atau agak berkerut dibanding koloni yang sangat berlendir.

2. Trichoderma

Media umum: PDA / TSM Sumber umum: kompos matang, akar bambu, serasah sehat, tanah organik

Ciri	Morfologi umum
Warna awal	putih
Warna lanjut	hijau muda, hijau tua, hijau kebiruan
Bentuk	menyebar melingkar
Tepi	halus sampai berfilamen
Permukaan	seperti kapas saat muda, bertepung saat matang
Elevasi	datar menyebar
Ukuran	besar, cepat memenuhi cawan
Kecepatan tumbuh	cepat, 2–5 hari
Tekstur	kapas, beludru, lalu bertepung

Ciri yang dicari: koloni awal putih cepat tumbuh, kemudian berubah hijau, tidak berbau busuk, dan tepi koloni aktif.

Catatan: untuk pemurnian, ambil bagian tepi koloni yang masih aktif, bukan bagian tengah yang terlalu tua.

3. PSB — Bakteri Pelarut Fosfat

Media umum: Pikovskaya / NBRIP Sumber umum: rizosfer cabai sehat, akar bambu, tanah kebun organik

PSB adalah kelompok fungsi, bukan satu genus. Isolat PSB bisa berasal dari Bacillus, Pseudomonas, Paenibacillus, Aspergillus, atau Penicillium.

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih, krem, kuning muda, bening
Bentuk	bulat, kecil sampai sedang
Tepi	rata sampai sedikit bergelombang
Permukaan	halus, licin, kadang agak kering
Elevasi	datar sampai cembung
Ukuran	kecil sampai sedang
Kecepatan tumbuh	2–5 hari
Tekstur	licin atau kering ringan
Ciri utama	ada zona bening di sekitar koloni

Ciri yang dicari: koloni dengan zona bening jelas dan stabil.

Skor sederhana zona bening:

Hasil	Keterangan
Tidak ada zona	negatif
Zona samar	lemah
Zona sedang	cukup baik
Zona lebar dan jelas	sangat potensial

4. KSB — Bakteri Pelarut Kalium

Media umum: Aleksandrov Agar Sumber umum: akar alang-alang, rizosfer rumput, jagung, tanah mineral, kebun kering

KSB juga merupakan kelompok fungsi, bukan satu genus. Contohnya dapat berupa Bacillus, Paenibacillus, Frateuria, atau mikroba pelarut mineral lain.

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih, krem, kuning pucat
Bentuk	bulat sampai tidak beraturan
Tepi	rata, bergelombang
Permukaan	halus, agak kering, kadang berlendir ringan
Elevasi	datar sampai cembung
Ukuran	kecil sampai sedang
Kecepatan tumbuh	sedang, 3–7 hari
Tekstur	halus atau kering ringan
Ciri utama	zona bening di sekitar koloni

Ciri yang dicari: koloni tumbuh baik pada Aleksandrov dan membentuk zona bening di sekitar koloni.

Catatan: zona bening KSB kadang tidak setegas PSB, jadi pilih koloni yang zonanya konsisten saat diuji ulang.

5. Streptomyces

Media umum: Starch Casein Agar Sumber umum: serasah sehat, tanah remah agak kering, kompos matang, akar bambu

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih, krem, abu-abu, cokelat muda
Bentuk	bulat tidak sempurna, berfilamen halus
Tepi	tidak rata, berumbai, berfilamen
Permukaan	kering, bertepung, seperti kapur
Elevasi	datar sampai sedikit timbul
Ukuran	kecil sampai sedang
Kecepatan tumbuh	lambat, 5–10 hari
Tekstur	kering, powdery, chalky
Aroma	sering berbau tanah

Ciri yang dicari: koloni kering, bertepung, tumbuh lambat, tidak berlendir, dan beraroma tanah ringan.

Catatan: jangan tertukar dengan jamur. Streptomyces biasanya lebih kompak, kering, dan tidak membentuk miselium kapas menyebar seperti jamur cepat tumbuh.

6. Jamur Dekomposer

Media umum: PDA Sumber umum: serasah sehat, kompos matang, tanah bawah serasah, akar bambu

Jamur dekomposer adalah kelompok luas. Bisa mencakup Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, dan jamur saprofit lain.

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih, hijau, abu-abu, hitam, kuning, cokelat
Bentuk	menyebar melingkar atau tidak beraturan
Tepi	berfilamen, bercabang, menyebar
Permukaan	kapas, beludru, tepung, granular
Elevasi	datar menyebar sampai menggumpal
Ukuran	sedang sampai besar
Kecepatan tumbuh	cepat sampai sangat cepat
Tekstur	kapas, tepung, beludru

Ciri yang dicari: untuk tujuan dekomposer, pilih jamur yang tumbuh stabil, tidak berbau busuk, dan tidak terlalu invasif menutup semua koloni lain terlalu cepat.

Catatan: untuk pemula, prioritaskan jamur yang tampak stabil dan mudah dimurnikan. Hindari jamur hitam yang sangat cepat menutup seluruh cawan bila tujuan utamanya bukan dekomposer.

7. Pseudomonas fluorescens

Media umum: King’s B Agar Sumber umum: rizosfer cabai sehat, tanah lembap sekitar akar, rizosfer tanaman sehat

Ciri	Morfologi umum
Warna	putih transparan, krem, kekuningan pucat
Bentuk	bulat
Tepi	rata
Permukaan	halus, licin, mengilap
Elevasi	datar sampai sedikit cembung
Ukuran	kecil sampai sedang
Kecepatan tumbuh	cepat, 24–48 jam
Tekstur	licin, lembap
Ciri khusus	beberapa isolat berfluoresensi hijau-kuning di bawah UV

Ciri yang dicari: koloni halus, licin, tumbuh baik pada King’s B, dan bila tersedia lampu UV, menunjukkan fluoresensi.

Catatan: tidak semua Pseudomonas fluoresen, dan tidak semua koloni fluoresen otomatis aman atau bermanfaat. Tetap perlu uji lanjut.

8. Azotobacter

Media umum: Ashby Mannitol Agar Sumber umum: tanah subur, rizosfer rumput, rizosfer cabai sehat, kebun organik

Ciri	Morfologi umum
Warna	bening, putih susu, krem
Bentuk	bulat
Tepi	rata
Permukaan	licin, mukoid, kadang berlendir
Elevasi	cembung
Ukuran	sedang sampai besar
Kecepatan tumbuh	sedang, 2–5 hari
Tekstur	licin, berlendir ringan sampai mukoid

Ciri yang dicari: koloni tumbuh pada media bebas nitrogen, tampak licin/mukoid, dan stabil saat dipindah ulang.

Catatan: kemampuan tumbuh di media bebas nitrogen masih indikasi awal, belum cukup untuk menyatakan kemampuan penambatan nitrogen kuat.

9. Azospirillum

Media umum: N-free Malate semi-solid Sumber umum: akar rumput, alang-alang, jagung, padi, tanaman berakar serabut

Ciri	Morfologi umum
Bentuk pertumbuhan	pelikel/cincin di bawah permukaan media semi-padat
Warna	putih keruh, tipis
Posisi	beberapa mm di bawah permukaan media
Kecepatan tumbuh	sedang, 3–7 hari
Tekstur	bukan koloni padat di permukaan agar, tetapi lapisan tipis

Ciri yang dicari: terbentuk pelikel tipis seperti cincin di bawah permukaan media semi-padat.

Catatan: ini bukan target paling mudah untuk pemula, karena interpretasi hasilnya lebih sulit daripada koloni pada cawan agar.

10. Endofit

Media umum: NA/TSA untuk bakteri endofit, PDA untuk jamur endofit Sumber umum: akar, batang, atau daun tanaman sehat setelah sterilisasi permukaan

Ciri	Morfologi umum
Warna	sangat bervariasi
Bentuk	bulat, tidak beraturan, atau berfilamen
Tepi	rata sampai tidak rata
Permukaan	halus, kering, kapas, tergantung jenis
Elevasi	bervariasi
Ukuran	kecil sampai sedang
Kecepatan tumbuh	lambat sampai cepat
Tekstur	bervariasi

Ciri yang dicari: koloni yang tumbuh dari jaringan steril permukaan, bukan dari kontaminan luar.

Catatan penting: endofit tidak cocok untuk latihan awal karena perlu sterilisasi permukaan jaringan. Jika teknik kurang rapi, mikroba permukaan akar/daun akan ikut tumbuh dan dikira endofit.

11. Mikoriza

Media umum: bukan media agar biasa Sumber umum: tanah dekat akar tanaman sehat, terutama tanaman yang tumbuh baik pada tanah miskin P

Ciri	Morfologi umum
Bentuk target	spora di tanah dan kolonisasi akar
Warna spora	kuning, cokelat, oranye, bening, tergantung genus
Ukuran spora	mikroskopis sampai terlihat dengan bantuan lup/mikroskop
Media tumbuh	perlu akar hidup/inang
Kecepatan	lambat
Ciri utama	membentuk asosiasi dengan akar tanaman

Ciri yang dicari: spora mikoriza di tanah dan kolonisasi akar, bukan koloni seperti bakteri atau jamur biasa di cawan agar.

Catatan: mikoriza tidak disarankan untuk isolasi pemula karena tidak mudah dikultur di media agar biasa.

Lampiran 9. Ciri Morfologi Berdasarkan Paket Pemula

Paket 1 — Kompos Matang

Target: Trichoderma + Bacillus Media: PDA + NA

Target	Ciri utama yang dicari
Trichoderma	koloni putih cepat tumbuh, berubah hijau, tekstur kapas/tepung
Bacillus	koloni putih/krem, agak kering, kadang berkerut, tumbuh cepat

Paket 2 — Akar Bambu

Target: Bacillus + Trichoderma + PSB Media: NA + PDA + Pikovskaya

Target	Ciri utama yang dicari
Bacillus	putih/krem, kering, tepi bergelombang, tumbuh cepat
Trichoderma	putih lalu hijau, menyebar cepat di PDA
PSB	koloni dengan zona bening di Pikovskaya

Paket 3 — Akar Alang-Alang

Target: Bacillus + KSB + mikroba tahan stres Media: NA + Aleksandrov

Target	Ciri utama yang dicari
Bacillus	koloni kering, stabil, putih/krem
KSB	koloni dengan zona bening di Aleksandrov
Mikroba tahan stres	koloni yang tetap tumbuh baik dari sumber kering/miskin hara dan stabil saat dimurnikan

Paket 4 — Rizosfer Cabai Sehat

Target: PGPM spesifik cabai Media: NA + Pikovskaya

Target	Ciri utama yang dicari
PGPR umum	koloni terpisah, stabil, tidak berbau busuk
Bacillus	putih/krem, kering, kadang berkerut
Pseudomonas	halus, licin, krem/bening, tumbuh cepat
PSB	zona bening di Pikovskaya
Calon APH rizosfer	koloni stabil yang nantinya diuji antagonis

Paket 5 — Serasah Sehat

Target: Jamur dekomposer + Streptomyces Media: PDA + Starch Casein Agar

Target	Ciri utama yang dicari
Jamur dekomposer	koloni kapas/beludru/tepung, warna bervariasi, tumbuh pada PDA
Trichoderma potensial	putih cepat tumbuh lalu hijau
Streptomyces	kering, bertepung, tumbuh lambat, aroma tanah, pada Starch Casein Agar

Ringkasan Seleksi Visual untuk Pemula

Target	Media	Ciri paling mudah dikenali
Bacillus	NA/TSA	koloni putih-krem, kering, agak berkerut
Trichoderma	PDA/TSM	putih cepat tumbuh lalu hijau
PSB	Pikovskaya/NBRIP	zona bening
KSB	Aleksandrov	zona bening, biasanya lebih samar
Pseudomonas	King’s B	koloni licin, beberapa fluoresen
Streptomyces	Starch Casein Agar	kering, bertepung, tumbuh lambat
Jamur dekomposer	PDA	kapas/beludru/tepung, warna bervariasi
Azotobacter	Ashby	koloni licin/mukoid pada media bebas N
Azospirillum	N-free Malate	pelikel/cincin di bawah permukaan
Mikoriza	akar hidup/inang	spora dan kolonisasi akar, bukan koloni agar

Catatan Penyusunan Artikel ini disusun sebagai materi edukasi dan referensi umum berdasarkan berbagai sumber pustaka, praktik lapangan, serta bantuan alat penulisan. Pembaca disarankan untuk melakukan verifikasi lanjutan dan penyesuaian sesuai dengan kondisi serta kebutuhan masing-masing sistem.